Restrikčná analýza DNA - popis metódy

Restrikčné endonukleázy (restriktázy) patria medzi najčastejšie používané enzýmy v molekulárnej biológii. Restriktázy sa vo veľkej miere využívajú pri príprave rekombinantných DNA, pri analýze genetických polymorfizmov a mutácií, pri mapovaní génov, identifikácii jedincov a pod. Sú to enzýmy, ktoré rozoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie na DNA a pri nájdení takejto sekvencie štiepia obidve vlákna DNA. Ide teda o "nožnice na DNA", pomocou ktorých môžeme "strihať" DNA v presne určených miestach a vzniknuté fragmenty využiť v ďalších experimentoch, alebo opačne - na základe prítomnosti rozštiepenia DNA môžeme identifikovať sekvenciu DNA v mieste štiepenia.
Restriktázy boli objavené pri štúdiu mechanizmov restrikcie a modifikácie. Restrikčno – modifikačné systémy majú dôležitú funkciu pri ochrane bakteriálnych buniek pred vstupom cudzorodej DNA. V priebehu uplynulých desaťročí boli izolované stovky restrikčných endonukleáz z viac ako 200 rozličných bakteriálnych druhov. Názvoslovie restrikčných endonukleáz je odvodené od bakteriálneho kmeňa, z ktorého sa enzým izoloval, pričom prvé písmeno pochádza z rodového názvu a ďalšie písmená z druhového názvu a kmeňa baktérie, rímske číslo udáva poradie izolovaného enzýmu, napr. EcoR I (Escherichia coli), Pvu II (Proteus vulgaris), Hha I (Haemophilus haemolyticus).
Restriktázy sa na základe špecifickosti štiepenia rozdeľujú do troch tried:
1. Prvú triedu tvoria enzýmy, ktoré poznávajú špecifickú sekvenciu na DNA, ale štiepenie uskutočňujú vo vzdialenosti 1000 až 5000 bp od nej. Pri štiepení vyžadujú prítomnosť ATP, Mg²⁺ iónov a S-adenozyl-metionínu. Patria sem napríklad Eco B a Eco K (Escherichia coli).
2. Enzýmy druhej triedy štiepia DNA na miestach, v ktorých sa nachádza špecifická sekvencia báz – tzv. cieľové miesto príslušnej endonukleázy. Cieľovým miestom býva najčastejšie sekvencia štyroch, piatich alebo šiestich (zriedkakedy viacerých) báz usporiadaných palindromicky, t. j. tak, že pri čítaní v smere 5` - 3` majú na obidvoch vláknach DNA rovnaké poradie báz. Na reakciu potrebujú len prítomnosť Mg²⁺ iónov. Niektoré restriktázy (napríklad Eco RI) štiepia DNA tak, že vznikajú prečnievajúce jednovláknové konce (pozri obrázok). Nazývajú sa kohézne („lepkavé“) konce, lebo majú tendenciu reasociovať na základe komplementarity báz do pôvodného stavu. Iné restrikčné endonukleázy (napríklad Hae III izolovaná z Haemophilus aegyptius) vytvárajú fragmenty s „tupými“ koncami.

3. Tretiu triedu tvoria enzýmy, ktoré štiepia DNA v presne definovaných miestach, toto miesto však zvyčajne netvorí palindromické sekvencie. Štiepenie nastáva o niekoľko nukleotidov od poznávacej sekvencie. Príkladom restriktázy tretej triedy je Fok I (Flavobacterium okeanokoites).
Dnes poznáme niekoľko sto restrikčných endonukleáz, z ktorých však mnohé rozoznávajú a štiepia rovnaké sekvencie. Enzýmy, ktoré majú rovnaké cieľové sekvencie, sa nazývajú izoschizoméry.