Polymerázová reťazová reakcia (PCR) - popis metódy

Polymerázová reťazová reakcia (Polymerase Chain Reaction, PCR) sa využíva na amplifikáciu - namnoženie špecifických úsekov DNA. PCR v podstate napodobňuje replikáciu DNA v podmienkach in vitro s tým rozdielom, že v PCR sa nereplikuje celá DNA ale len jej úsek. PCR obsahuje nasledovné zložky:
• Taq DNA polymerázu - termostabilný enzým syntetizujúci nové vlákno DNA,
• Mg2+ - aktivujú DNA polymerázu,
• primery - syntetické jednovláknové oligonukleotidy s dĺžkou 17 - 30 báz. Svojou polohou po hybridizácii vymedzujú požadovaný úsek na molekule DNA, ktorý chceme amplifikovať. Prvý primer sa viaže na jedno vlákno DNA, druhý sa viaže na druhé komplementárne vlákno denaturovanej DNA.
• dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) – stavebné zložky syntetizovaného vlákna DNA,
• templátovú DNA
Amplifikácia DNA v PCR je cyklický proces, ktorý pozostáva z 3 krokov:
• denaturácie dvojvláknovej chromozomálnej DNA pri 94 °C,
• hybridizácie (annealingu) primerov pri teplote špecifickej pre každý pár primerov,
• polymerizácie - syntézy nových vlákien DNA pri 72 °C.
Reakcia zvyčajne obsahuje 30 - 40 cyklov, v priebehu ktorých sa jednotlivé kroky opakujú, pričom pôvodný templát a podľa neho nasyntetizované kópie slúžia ako predlohy pre vznik ďalších produktov. V každom cykle (t.j. v troch vyššie uvedených krokoch) sa teda počet molekúl DNA zdvojnásobí. Po 30 - 40 cykloch je možné dosiahnuť namnoženie 10⁵- 10⁶ kópií a teda z pôvodných napr. niekoľko desiatok či stoviek molekúl DNA je možné získať rádovo nanogramy cieľovej sekvencie, čo je dostatočné množstvo pre detekciu (elektroforeticky), prípadne pre ďalšie spracovanie. Teplotný režim sa pred PCR naprogramuje do automatických programovateľných prístrojov – termocyklerov, ktoré zabezpečujú striedanie teplôt v krátkych časových úsekoch.