Elektroforéza DNA II (polyakrylamidová - PAGE) - popis metódy

Elektroforetické metódy sú fyzikálno – chemické metódy, ktoré sa používajú na separáciu látok nesúcich elektrické náboje. Ak sa zmes takýchto látok vystaví v určitom prostredí pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu molekúl. Ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily elektrického poľa. Veľkosť náboja molekuly ovplyvňuje stupeň ionizácie, pH a iónová sila prostredia. Elektroforézou sa môžu deliť nízkomolekulové i vysokomolekulové látky. V molekulárnej biológii sa pri separácii látok používajú ako nosiče najčastejšie agarózové a polyakrylamidové gély. Gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri elektroforéze rozdelili aj také látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale rozličnú veľkosť molekúl. Podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a polyakrylamidovú (PAGE).

Polyakrylamidovú elektroforézu (PAGE) je možné využiť na separáciu nukleových kyselín i proteínov. Polyakrylamidový gél má veľmi dobré mechanické vlastnosti, je priesvitný, pri príprave sa dá zabezpečiť vyžadovaná veľkosť pórov, štruktúra gélu je veľmi dobre reprodukovateľná, má zo všetkých nosičov má najväčšiu rozlišovaciu kapacitu. Polyakrylamidový gél vzniká polymerizáciou základného akrylamidového monoméru a sieťovacieho monoméru N,N´-metylén-bis-akrylamidu (BIS):
CH₂=CH-CO-NH₂ akrylamidový monomér
CH₂=CH-CO-NH-CH₂–NH-CO-CH=CH₂ N,N´-metylén-bis-akrylamid (BIS)
Akrylamid a BIS sú toxické, preto treba s nimi opatrne manipulovať! Polymér už nie je toxický. Polymerizáciou vznikajú dlhé vlákna polyakrylamidu, ktoré sa priečne viažu pomocou BIS do priestorovej siete. Póry polyméru majú rozličnú veľkosť podľa koncentrácie akrylamidu a BIS: ich veľkosť je nepriamo úmerná koncentrácii akrylamidu, pri BIS vznikajú najmenšie póry vtedy, keď polymerizačná zmes obsahuje 5 % BIS. Ak je koncentrácia BIS väčšia alebo menšia, vznikajú póry s väčším priemerom. Pri príprave polyakrylamidových gélov je preto koncentrácia BIS 1 až 5 %. Veľkosť pórov v 6,5 až 20 % polyakrylamidových géloch, ktoré obsahujú až 2 až 5 % BIS, je 4,0 až 0,6 um. Na začatie polymerizačnej reakcie sú potrebné voľné radikály a katalyzátor. Ako katalyzátor sa používa TEMED (N,N,N´,N´-tetrametyléndiamín), persíran amónny poskytuje voľné kyslíkové radikály. Polymerizácia akrylamidu v prítomnosti TEMED a persíranu amónneho je pri laboratórnej teplote rýchla. Základné zariadenie na elektroforézu sa skladá z elektroforetickej komory a zdroja jednosmerného elektrického prúdu. Elektroforetická komora obsahuje elektrolyt a priestor na umiestenie gélu. Polyakrylamidový gél sa pripravuje vo forme platní na sklách s rozličnými rozmermi, ktoré bývajú počas elektroforézy vo vertikálnej polohe.

Na separáciu proteínov podľa veľkosti molekúl sa využíva PAGE v prostredí dodecylsíranu sodného (SDS). SDS sa viaže na peptidové väzby a zásadité skupiny proteínov, v dôsledku čoho všetky proteíny získajú skoro rovnako veľký záporný náboj (počas elektroforézy sa pohybujú k anóde) a pri elektroforéze sa potom delia len podľa veľkosti svojich molekúl – menšie molekuly sa pohybujú rýchlejšie, veľké molekuly pomalšie. Ak sa k proteínom pridá SDS a redukujúce látky (2-merkaptoetanol, ditiotreitol) s následnou tepelnou denaturáciou, rozruší sa ich trojrozmerná konformácia a molekuly zaujmú približne rovnaký tvar. Proteíny môžeme deliť aj bez prítomnosti SDS, v tomto prípade sa bielkoviny nedelia podľa veľkosti molekuly (tzv. natívna PAGE). Pri elektroforéze proteínov pomocou SDS-PAGE sa pripravuje gél pozostávajúci z dvoch koncentračne odlišných častí – koncentrovanejší deliaci gél (v spodnej časti platne) a menej koncentrovaný štartovací gél. Farbenie gélu sa uskutočňuje špecifickými farbivami, napr. Coomassie Brilliant Blue R-250 alebo farbením pomocou dusičnanu strieborného (farbenie striebrom).

V rámci elektroforézy nukleových kyselín PAGE umožňuje separáciu malých molekúl DNA s veľkosťou 50 – 500 bp s rozlíšením 1 bp. V praxi sa pripravujú gély s koncentráciou 4 - 12 % v závislosti od veľkosti separovaných fragmentov. Elektroforéza prebieha v elektródových tlmivých roztokoch pri napätí 2 000 – 3 000 V. Pri PAGE nukleových kyselín pripravujeme len jeden typ gélu (deliaci). Farbenie gélov sa uskutočňuje pomocou dusičnanu strieborného (farbenie striebrom), prípadne fluorescenčne alebo autorádiograficky. Na separáciu nukleových kyselín podľa veľkosti molekúl sa využíva denaturačná PAGE, kde sa na gél sa nanáša teplotne denaturovaná DNA a delenie prebieha za prítomnosti denaturantu (8 M močovina, formamid). Podobne ako proteíny, aj nukleové kyseliny je možné deliť bez denaturácie (natívna PAGE), molekuly sa však neseparujú podľa veľkosti.