Elektroforéza DNA I (agarózová) - popis metódy
Elektroforetické metódy sú fyzikálno – chemické metódy, ktoré sa používajú na separáciu látok nesúcich elektrické náboje. Ak sa zmes takýchto látok vystaví v určitom prostredí pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu molekúl. Ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily elektrického poľa. Veľkosť náboja molekuly ovplyvňuje stupeň ionizácie, pH a iónová sila prostredia. Elektroforézou sa môžu deliť nízkomolekulové i vysokomolekulové látky. V molekulárnej biológii sa pri separácii látok používajú ako nosiče najčastejšie agarózové a polyakrylamidové gély. Gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri elektroforéze rozdelili aj také látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale rozličnú veľkosť molekúl. Podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a polyakrylamidovú (PAGE).
Elektroforéza v agarózovom géle patrí medzi základné metódy na
separáciu (oddelenie) a identifikáciu nukleových kyselín. Možno ňou
deliť fragmenty DNA s veľkosťou približne 20 – 20 000 bp s rozlíšením
približne 5 bp (špeciálne typy agarózy, vo väčšine prípadov je
rozlíšenie nižšie, t.j. viac bp). Počas elektroforézy sa molekuly
nukleovej kyseliny pohybujú v elektrickom poli (DNA je záporne nabitá)
v agarózovom géle a separujú sa na základe ich veľkosti (bázových
párov) – malé molekuly sa pohybujú rýchlejšie, veľké molekuly pomalšie.
Gél môže obsahovať interkalačné činidlo, ktoré sa počas migrácie
nukleovej kyseliny začleňuje medzi dusíkaté bázy DNA a po elektroforéze
umožňuje pozorovanie jednotlivých fragmentov separovanej DNA v
ultrafialovom svetle. Agaróza je polymér disacharidu agarobiózy. Pri
príprave gélu sa agaróza rozpúšťa v horúcich tlmivých roztokoch
(napríklad Tris-borátový alebo Tris-acetátový tlmivý roztok). Ak
teplota klesne pod 45 °C, vzniká polotuhý gél. Pri väčšine separácií sa
používa gél, ktorý obsahuje 0,5 – 6,0 % agarózy v závislosti od
veľkosti separovaných fragmentov. Základné zariadenie na elektroforézu
sa skladá z elektroforetickej komory a zdroja jednosmerného
elektrického prúdu. Elektroforetická komora má katódový a anódový
priestor s elektrolytom a priestor na umiestenie nosiča. Najlepšie
rozdelenie fragmentov DNA prebieha pri napätí, ktoré nie je väčšie ako
5 V/cm.
Maximálne množstvo DNA, ktoré je možné naniesť do dráhy na
elektroforézu, závisí od množstva a veľkosti fragmentov vo vzorke.
Najmenšie množstvo DNA, ktoré je možné naniesť na elektroforézu, závisí
od možnosti vizualizácie a schopnosti zachytiť ho pri fotografovaní, čo
je asi 2 – 10 ng pri šírke dráhy 0,5 cm. Pri bežnej analýze sa na jednu
dráhu nanáša približne 0,2 až 0,5 ug DNA. Vzorka sa do gélu nanáša
zmiešaná s nanášacou zmesou, ktorá obsahuje farbivo (brómfenolová
modrá, xyléncyanolová zelená), glycerol a EDTA. Farbivo umožňuje
sledovať približný pohyb fragmentov počas elektroforézy, glycerol
zabezpečuje účinné nanášanie vzorky do jamky v géle. Nanášací roztok
obsahuje aj chelatačné činidlo EDTA, ktoré viaže ióny dôležité pre
činnosť mnohých enzýmov a tým ich inaktivuje (restrikčné endonukleázy).
Najjednoduchšou metódou vizualizácie DNA v agarózových géloch
je vyfarbovanie fluoreskujúcim farbivom – etídiumbromidom (EtBr).
Molekula etídiumbromidu (3,8-diamino-5-etyl-6-fenylfenantridínium
bromid) sa interkaluje medzi zásady DNA. Komplexy EtBr s DNA po
ožiarení UV lúčmi s vlnovou dĺžkou 302 nm oranžovo fluoreskujú. EtBr sa
pridáva do agarózového gélu počas jeho prípravy. Etídiumbromid je silné
mutagénne činidlo, preto pri manipulácii s gélmi a roztokmi je
nevyhnutné použiť gumové rukavice! Veľkosť separovaných fragmentov sa
zisťuje porovnaním s markermi molekulových hmotností. V súčasnosti je
komerčne dostupných mnoho rozličných markerov, výber vhodného markera
závisí od konkrétnej aplikácie.