Elektroforéza DNA I (agarózová) - popis metódy

Elektroforetické metódy sú fyzikálno – chemické metódy, ktoré sa používajú na separáciu látok nesúcich elektrické náboje. Ak sa zmes takýchto látok vystaví v určitom prostredí pôsobeniu elektrického poľa, dochádza k pohybu molekúl. Ich pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia (napríklad charakter nosiča) a sily elektrického poľa. Veľkosť náboja molekuly ovplyvňuje stupeň ionizácie, pH a iónová sila prostredia. Elektroforézou sa môžu deliť nízkomolekulové i vysokomolekulové látky. V molekulárnej biológii sa pri separácii látok používajú ako nosiče najčastejšie agarózové a polyakrylamidové gély. Gély majú charakter molekulových sít, čo umožňuje, aby sa pri elektroforéze rozdelili aj také látky, ktoré majú rovnaký náboj, ale rozličnú veľkosť molekúl. Podľa príslušného gélu rozlišujeme elektroforézu agarózovú a polyakrylamidovú (PAGE). 

Elektroforéza v agarózovom géle patrí medzi základné metódy na separáciu (oddelenie) a identifikáciu nukleových kyselín. Možno ňou deliť fragmenty DNA s veľkosťou približne 20 – 20 000 bp s rozlíšením približne 5 bp (špeciálne typy agarózy, vo väčšine prípadov je rozlíšenie nižšie, t.j. viac bp). Počas elektroforézy sa molekuly nukleovej kyseliny pohybujú v elektrickom poli (DNA je záporne nabitá) v agarózovom géle a separujú sa na základe ich veľkosti (bázových párov) – malé molekuly sa pohybujú rýchlejšie, veľké molekuly pomalšie. Gél môže obsahovať interkalačné činidlo, ktoré sa počas migrácie nukleovej kyseliny začleňuje medzi dusíkaté bázy DNA a po elektroforéze umožňuje pozorovanie jednotlivých fragmentov separovanej DNA v ultrafialovom svetle. Agaróza je polymér disacharidu agarobiózy. Pri príprave gélu sa agaróza rozpúšťa v horúcich tlmivých roztokoch (napríklad Tris-borátový alebo Tris-acetátový tlmivý roztok). Ak teplota klesne pod 45 °C, vzniká polotuhý gél. Pri väčšine separácií sa používa gél, ktorý obsahuje 0,5 – 6,0 % agarózy v závislosti od veľkosti separovaných fragmentov. Základné zariadenie na elektroforézu sa skladá z elektroforetickej komory a zdroja jednosmerného elektrického prúdu. Elektroforetická komora má katódový a anódový priestor s elektrolytom a priestor na umiestenie nosiča. Najlepšie rozdelenie fragmentov DNA prebieha pri napätí, ktoré nie je väčšie ako 5 V/cm.

Maximálne množstvo DNA, ktoré je možné naniesť do dráhy na elektroforézu, závisí od množstva a veľkosti fragmentov vo vzorke. Najmenšie množstvo DNA, ktoré je možné naniesť na elektroforézu, závisí od možnosti vizualizácie a schopnosti zachytiť ho pri fotografovaní, čo je asi 2 – 10 ng pri šírke dráhy 0,5 cm. Pri bežnej analýze sa na jednu dráhu nanáša približne 0,2 až 0,5 ug DNA. Vzorka sa do gélu nanáša zmiešaná s nanášacou zmesou, ktorá obsahuje farbivo (brómfenolová modrá, xyléncyanolová zelená), glycerol a EDTA. Farbivo umožňuje sledovať približný pohyb fragmentov počas elektroforézy, glycerol zabezpečuje účinné nanášanie vzorky do jamky v géle. Nanášací roztok obsahuje aj chelatačné činidlo EDTA, ktoré viaže ióny dôležité pre činnosť mnohých enzýmov a tým ich inaktivuje (restrikčné endonukleázy).

Najjednoduchšou metódou vizualizácie DNA v agarózových géloch je vyfarbovanie fluoreskujúcim farbivom – etídiumbromidom (EtBr). Molekula etídiumbromidu (3,8-diamino-5-etyl-6-fenylfenantridínium bromid) sa interkaluje medzi zásady DNA. Komplexy EtBr s DNA po ožiarení UV lúčmi s vlnovou dĺžkou 302 nm oranžovo fluoreskujú. EtBr sa pridáva do agarózového gélu počas jeho prípravy. Etídiumbromid je silné mutagénne činidlo, preto pri manipulácii s gélmi a roztokmi je nevyhnutné použiť gumové rukavice! Veľkosť separovaných fragmentov sa zisťuje porovnaním s markermi molekulových hmotností. V súčasnosti je komerčne dostupných mnoho rozličných markerov, výber vhodného markera závisí od konkrétnej aplikácie.