Restrikčná analýza DNA - Manuály
Štiepenie plazmidovej a genómovej DNA restrikčnou endonukleázou
Štiepenie DNA restrikčnou endonukleázou na fragmenty prebieha v skúmavke, pričom samotný proces nie je viditeľný voľným okom. Aby sme mohli skontrolovať výsledok štiepenia, produkty reakcie (fragmenty DNA) je potrebnéod seba oddeliť a vizualizovať pomocou elektroforézy DNA.
Chemikálie: roztok pDNA (pBluescrip SK) a genómovej DNA, 10 x koncentrovaný tlmivý roztok pre príslušnú restrikčnú endonukleázu, restrikčná endonukleáza (HindIII, RsaI), sterilná redestilovaná voda, chemikálie pre agarózovú elektroforézu
Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, zariadenie na elektroforézu, UV transiluminátor
Postup:
1. do mikroskúmavky napipetujeme postupne 13,5 μl sterilnej
redestilovanej vody, 2 μl 10x koncentrovaného tlmivého roztoku pre
restrikčnú endonukleázu (je dodávaný spolu s enzýmom), 0,5 μl
restrikčnej endonukleázy (3-5 U), 4 μl roztoku pDNA alebo genómovej DNA
s koncentráciou 0,2-0,4 μg/μl
2. vzorky umiestnime do termostatu na 1
hodinu pri teplote 37 °C
3. vzorky vyberieme z termostatu a štiepenie
zastavíme pridaním 4 μl nanášacieho roztoku
4. poštiepené fragmenty DNA
odseparujeme elektroforeticky v 1 % agarózovom géle a vizualizujeme v
UV svetle na UV transiluminátore