Restrikčná analýza DNA - Manuály

Štiepenie plazmidovej a genómovej DNA restrikčnou endonukleázou 

Štiepenie DNA restrikčnou endonukleázou na fragmenty prebieha v skúmavke, pričom samotný proces nie je viditeľný voľným okom. Aby sme mohli skontrolovať výsledok štiepenia, produkty reakcie (fragmenty DNA) je potrebnéod seba oddeliť a vizualizovať pomocou elektroforézy DNA.

Chemikálie: roztok pDNA (pBluescrip SK) a genómovej DNA, 10 x koncentrovaný tlmivý roztok pre príslušnú restrikčnú endonukleázu, restrikčná endonukleáza (HindIII, RsaI), sterilná redestilovaná voda, chemikálie pre agarózovú elektroforézu 

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, zariadenie na elektroforézu, UV transiluminátor 

Postup: 
1. do mikroskúmavky napipetujeme postupne 13,5 μl sterilnej redestilovanej vody, 2 μl 10x koncentrovaného tlmivého roztoku pre restrikčnú endonukleázu (je dodávaný spolu s enzýmom), 0,5 μl restrikčnej endonukleázy (3-5 U), 4 μl roztoku pDNA alebo genómovej DNA s koncentráciou 0,2-0,4 μg/μl
2. vzorky umiestnime do termostatu na 1 hodinu pri teplote 37 °C
3. vzorky vyberieme z termostatu a štiepenie zastavíme pridaním 4 μl nanášacieho roztoku
4. poštiepené fragmenty DNA odseparujeme elektroforeticky v 1 % agarózovom géle a vizualizujeme v UV svetle na UV transiluminátore