Izolácia DNA - popis metódy

Pri analýze komplexných genómov metódami molekulárnej biológie je nevyhnutné izolovať čistú, vysokomolekulárnu DNA. Vzhľadom na veľkosť DNA v jednotlivých chromozómoch eukaryotických organizmov, ktorá dosahuje až niekoľko desiatok miliónov báz, je technicky veľmi náročné izolovať neporušené molekuly DNA v plnej dĺžke a manipulovať s nimi v in vitro podmienkach. Pre väčšinu experimentov to však ani nie je potrebné a úplne postačujúca je fragmentovaná DNA s dĺžkou fragmentov 70-150 kb.

Postup izolácie DNA obyčajne závisí od organizmu, z ktorého pri izolácii vychádzame. Cieľom izolácie je získať DNA s čo možno najväčšou relatívnou molekulovou hmotnosťou bez RNA, proteínov, polysacharidov. Metódy izolácie genómovej DNA z tkanív živočíchov a rastlín sú zvyčajne založené na troch základných krokoch:
1. šetrnej lýze buniek,
2. odstránení proteínov a ostatných vysokomolekulárnych zložiek bunky okrem DNA (tzv. čistenie – purifikácia DNA),
3. skoncentrovaní DNA (napríklad zrážaním).
Nevyhnutným predpokladom kvalitnej extrakcie DNA je dôkladné rozrušenie buniek a ich súčastí, ktoré prebieha obvykle v prostredí príslušného extrakčného média. Extrakčné médiá používané pri izolácii nukleových kyselín sa zvyčajne skladajú zo základného tlmivého roztoku, ku ktorému sa pridávajú deproteinizačné činidlá, detergenty a inhibítory nukleáz. Pri izolácii DNA z eukaryotických buniek, kde DNA tvorí pevné komplexy s histónovými a ďalšími proteínmi, do extrakčného roztoku pridávajú enzýmy proteázy, napríklad proteináza K. Proteináza K bola izolovaná z baktérie Tritirachium album. Prednostne štiepi peptidové väzby po karboxylovej skupine N-substituovaných aminokyselín, čím hydrolyzuje natívne proteíny. Z deproteinizačných prostriedkov sa na izoláciu nukleových kyselín môže použíť fenol a chloroform, alebo sa proteíny vyzrážajú nasýtenými roztokmi solí, napr. NaCl alebo octanom sodným (tzv. vysoľovanie). Fenol patrí medzi najefektívnejšie denaturačné činidlá, jeho veľkou nevýhodou je vysoká toxicita. V prípade použitia fenolu je potrebné jeho zvyšky odstrániť napríklad zmesou chloroformu s izoamylalkoholom v pomere 24 : 1. Chloroform tiež denaturuje bielkoviny, izoamylalkohol znižuje penenie zmesi, uľahčuje oddelenie vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu. Detergenty (SDS alebo N-lauryl sarkozín) pomáhajú deproteinizácii, pretože účinne uvoľňujú nukleové kyseliny z ich väzby na bielkoviny. Na vyzrážanie bielkovín je možné použiť aj roztoky solí, čo predstavuje výhodu v nahradení zdraviu škodlivých zlúčenín (fenol) neškodnými (NaCl), účinnosť deproteinizácie je však nižšia. Aktivita nukleáz – enzýmov, ktoré sa prirodzene vyskytujú v bunkách a degradujú DNA - sa inhibuje komplexotvornými činidlami, najčastejšie roztokom EDTA, pretože EDTA viaže ióny (napríklad Mg2+), ktoré nukleázy vyžadujú ku svojej aktivite. Aktivita nukleáz sa potlačí aj tým, že proteolytické štiepenie sa realizuje pri teplote až 60°C v prítomnosti ionogenných detergentov (SDS), ktoré tak isto inhibujú nukleázy. Posledným krokom v procese izolácie DNA je prevedenie čistej formy DNA do roztoku, použiteľného pre ďalšie analýzy. Čistú DNA môžeme získať napríklad vyzrážaním 95% etanolom alebo izopropylalkoholom, pričom na odstránenie solí zo vzorky využijeme premývanie 70% etanolom.

V súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie nukleových kyselín z rôznych zdrojov. Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu DNA z konkrétneho zdroja s vysokou účinnosťou. Zloženie jednotlivých komponentov súpravy býva v takýchto prípadoch často predmetom výrobného tajomstva. Vo všeobecnosti sa DNA najčastejšie izoluje z krvi, z chlpovej cibuľky, buniek sliznice ústnej dutiny, prípadne zo svalu alebo iných tkanív. DNA z rastlinných pletív sa izoluje ťažšie v porovnaní so živočíšnymi tkanivami vďaka pevnej bunkovej stene. Na jej rozrušenie sa používajú rôzne zmesi enzýmov (izolované napr. z Trichoderma reesei) alebo sa bunková stena rozruší pomocou tekutého dusíka. 

Komerčné súpravy na izoláciu DNA väčšinou pracujú na princípe:
- využitia matrixov – používajú látky, ktoré špecificky viažu DNA
- využitia kolóniek – používajú špeciálne dvojité skúmavky s membránou, ktorá špecificky prepúšťa rôzne typy látok
- s magnetickými časticami – sú to zväčša matrixové kity, kde matrix je naviazaná na magnetické častice, ktoré uľahčujú oddelenie matrixu od zmesi pomocou magnetického stojana.