Izolácia DNA - popis metódy
Pri analýze komplexných genómov metódami molekulárnej
biológie je nevyhnutné izolovať čistú, vysokomolekulárnu DNA. Vzhľadom
na veľkosť DNA v jednotlivých chromozómoch eukaryotických organizmov,
ktorá dosahuje až niekoľko desiatok miliónov báz, je technicky veľmi
náročné izolovať neporušené molekuly DNA v plnej dĺžke a manipulovať s
nimi v in vitro podmienkach.
Pre väčšinu experimentov to však ani nie je potrebné a úplne
postačujúca je fragmentovaná DNA s dĺžkou fragmentov 70-150 kb.
Postup izolácie DNA obyčajne závisí od organizmu, z ktorého
pri izolácii vychádzame. Cieľom izolácie je získať DNA s čo možno
najväčšou relatívnou molekulovou hmotnosťou bez RNA, proteínov,
polysacharidov. Metódy izolácie genómovej DNA z tkanív živočíchov a
rastlín sú zvyčajne založené na troch základných krokoch:
1. šetrnej lýze buniek,
2. odstránení proteínov a ostatných vysokomolekulárnych zložiek bunky
okrem DNA (tzv. čistenie – purifikácia DNA),
3. skoncentrovaní DNA (napríklad zrážaním).
Nevyhnutným predpokladom kvalitnej extrakcie DNA je dôkladné rozrušenie
buniek a ich súčastí, ktoré prebieha obvykle v prostredí príslušného
extrakčného média. Extrakčné médiá používané pri izolácii nukleových
kyselín sa zvyčajne skladajú zo základného tlmivého roztoku, ku ktorému
sa pridávajú deproteinizačné činidlá, detergenty a inhibítory nukleáz.
Pri izolácii DNA z eukaryotických buniek, kde DNA tvorí pevné komplexy
s histónovými a ďalšími proteínmi, do extrakčného roztoku pridávajú
enzýmy proteázy, napríklad proteináza K. Proteináza K bola izolovaná z
baktérie Tritirachium
album. Prednostne štiepi peptidové väzby po karboxylovej
skupine N-substituovaných aminokyselín, čím hydrolyzuje natívne
proteíny. Z deproteinizačných prostriedkov sa na izoláciu nukleových
kyselín môže použíť fenol a chloroform, alebo sa proteíny vyzrážajú
nasýtenými roztokmi solí, napr. NaCl alebo octanom sodným (tzv.
vysoľovanie). Fenol patrí medzi najefektívnejšie denaturačné činidlá,
jeho veľkou nevýhodou je vysoká toxicita. V prípade použitia fenolu je
potrebné jeho zvyšky odstrániť napríklad zmesou chloroformu s
izoamylalkoholom v pomere 24 : 1. Chloroform tiež denaturuje
bielkoviny, izoamylalkohol znižuje penenie zmesi, uľahčuje oddelenie
vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu. Detergenty (SDS
alebo N-lauryl sarkozín) pomáhajú deproteinizácii, pretože účinne
uvoľňujú nukleové kyseliny z ich väzby na bielkoviny. Na vyzrážanie
bielkovín je možné použiť aj roztoky solí, čo predstavuje výhodu v
nahradení zdraviu škodlivých zlúčenín (fenol) neškodnými (NaCl),
účinnosť deproteinizácie je však nižšia. Aktivita nukleáz – enzýmov,
ktoré sa prirodzene vyskytujú v bunkách a degradujú DNA - sa inhibuje
komplexotvornými činidlami, najčastejšie roztokom EDTA, pretože EDTA
viaže ióny (napríklad Mg2+), ktoré nukleázy vyžadujú ku svojej
aktivite. Aktivita nukleáz sa potlačí aj tým, že proteolytické
štiepenie sa realizuje pri teplote až 60°C v prítomnosti ionogenných
detergentov (SDS), ktoré tak isto inhibujú nukleázy. Posledným krokom v
procese izolácie DNA je prevedenie čistej formy DNA do roztoku,
použiteľného pre ďalšie analýzy. Čistú DNA môžeme získať napríklad
vyzrážaním 95% etanolom alebo izopropylalkoholom, pričom na odstránenie
solí zo vzorky využijeme premývanie 70% etanolom.
V súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie nukleových
kyselín z rôznych zdrojov. Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy
chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu DNA z konkrétneho zdroja s
vysokou účinnosťou. Zloženie jednotlivých komponentov súpravy býva v
takýchto prípadoch často predmetom výrobného tajomstva. Vo všeobecnosti
sa DNA najčastejšie izoluje z krvi, z chlpovej cibuľky, buniek sliznice
ústnej dutiny, prípadne zo svalu alebo iných tkanív. DNA z rastlinných
pletív sa izoluje ťažšie v porovnaní so živočíšnymi tkanivami vďaka
pevnej bunkovej stene. Na jej rozrušenie sa používajú rôzne zmesi
enzýmov (izolované napr. z Trichoderma
reesei) alebo sa bunková stena rozruší pomocou tekutého
dusíka.
Komerčné súpravy na izoláciu DNA väčšinou pracujú na princípe:
- využitia matrixov – používajú látky, ktoré špecificky viažu DNA
- využitia kolóniek – používajú špeciálne dvojité skúmavky s membránou, ktorá špecificky prepúšťa rôzne typy látok
- s magnetickými časticami – sú to zväčša matrixové kity, kde matrix je naviazaná na magnetické častice, ktoré uľahčujú oddelenie matrixu od zmesi pomocou magnetického stojana.