Polymerázová reťazová reakcia (PCR) - manuály
Určenie pohlavia
človeka pomocou PCR
Anotácia: Genetické určenie pohlavia u človeka je založené na
prítomnosti dvoch odlišných chromozómov v mužských bunkách (XY –
pohlavie heterogametické) a dvoch rovnakých chromozómoch v bunkách
ženských (XX – pohlavie homogametické). V rámci cvičení použijeme PCR
na simultánnu (spoločnú) amplifikáciu repetitívnej satelitnej sekvencie
DXZ4 (lokus na X chromozóme) a sekvencie génu SRY – testis
determinujúceho faktora (lokus na Y chromozóme) v jednej reakčnej
zmesi. V prípade vzorky mužského pohlavia sa amplifikujú obidve
sekvencie a vznikajú dva fragmenty s veľkosťou 91 a 204 bp,
amplifikáciou DNA zo vzorky ženského pohlavia vzniká jeden fragment s
veľkosťou 91 bp.
Chemikálie: PCR reakčný roztok (10 x konc.), MgCl2
(50
mmol/l), primery 1-4 (10 pmol/ μl), dNTP mix (2,5 mmol/l), Taq DNA
polymeráza (5 U/μl), sterilná redestilovaná voda, roztok ľudskej
genómovej DNA, chemikálie pre agarózovú elektroforézu
Pomôcky: mikroskúmavky (1,5 a 0,2 ml), mikropipety,
termocykler, PCR sterilný box, zariadenie na elektroforézu, UV
transiluminátor, rukavice
Postup:
1. v PCR boxe pripravíme reakčnú zmes PCR pre
stanovený počet vzoriek podľa tabuľky; výsledný objem reakčnej zmesi je
20 μl
| reagent5 |
koncentrácia |
objem na 1 vzorku |
objem na ... vzoriek |
| redestilovaná sterilná voda |
- |
8,9 ul |
|
| PCR reakčný roztok
(10x konc.) |
1x |
2,0
ul |
|
| MgCl2
(50 mmil/l) |
2,0
mmol/l |
0,8
ul |
|
| dNTP mix (2,5
mmol/l) |
0,2
mmol/l |
1,6
ul |
|
| primer 1 (10
pmol/ul) |
0,5
umol/l |
1,0
ul |
|
| primer 2 (10 pmol/ul) | 0,5 umol/l | 1,0 ul | |
| primer 3 (10 pmol/ul) | 0,5 umol/l | 1,0 ul | |
| primer 4 (10 pmol/ul) | 0,5 umol/l | 1,0 ul | |
| Taq DNA polymeráza
(5U/ul) |
1U |
0,2
ul |
|
| templátová DNA |
50
ng |
2,5
ul |
2. jednotlivé zložky (okrem templátovej DNA) zmiešame v
potrebných množstvách, rozpipetujeme po 17,5 μl do 0,2 ml skúmaviek a
nakoniec do každej skúmavky pridáme 2,5 μl templátovej DNA (jednotlivé
vzorky)
3. skúmavky umiestnime do termocyklera s nasledovným programom:
•
Denaturácia 4 min. pri 94 °C
• 28 x (denaturácia 1 min. pri 94 °C;
annealing 1 min. pri 59 °C; polymerizácia 1 min. pri 72 °C)
•
Polymerizácia 5 min. pri 72 °C.
4. po skončení PCR k vzorkám pridáme 4 μl nanášacieho roztoku a
naamplifikované fragmenty separujeme v 2 % agarózovom géle
5. na základe počtu a veľkosti fragmentov určíme pohlavie jedincov,
ktorým prislúchajú použité vzorky
