Sekvenovanie DNA - popis metódy
Princípom enzýmovej sekvenačnej metódy podľa Sangera je terminácia polymerizačnej reakcie, katalyzovanej DNA polymerázou, prostredníctvom inkorporácie 2´,3´ -dideoxynukleotidov do rastúceho reťazca DNA. Dideoxynukleotidy (ddNTP) neobsahujú hydroxylovú skupinu na 3´ uhlíku ribózy, ktorá sa zúčastňuje na tvorbe fosfodiesterovej väzby v reťazcoch DNA. Po zabudovaní ddNTP do vznikajúceho komplementárneho vlákna DNA sa k nemu nemôže pripojiť ďalší nukleotid a dochádza k terminácií reakcie. Sekvenovanie prebieha v 4 nezávislých reakciách, v ktorých sa nachádza malé množstvo (asi 1-4 % z celkového obsahu dNTP) jedného z ddNTP, jednovláknová DNA, najčastejšie ako klonovaný fragment vo vektore, primer komplementárny s vektorovou sekvenciou v blízkosti klonovaného fragmentu, alebo so známou časťou sekvencie fragmentu, zmes štyroch deoxynukleotidtrifosfátov (dNTP) s malým množstvom jedného označeného nukleotidu a DNA polymeráza. Produktom polymerizačnej reakcie v jednotlivých skúmavkach je zmes označených fragmentov s rôznou dĺžkou, ktoré majú identický 5´ koniec, tvorený primerom. Smerom k 3´ koncu fragmentov sa nachádza rôzne dlhá sekvencia, komplementárna s templátovou DNA a vždy ukončená príslušným ddNTP v danej reakcii. To znamená, že napr. všetky fragmenty vzniknuté v reakcii s ddGTP budú na 3´ konci ukončené týmto dideoxynukleotidom a budú tak určovať pozície nukleotidu C v templátovej DNA. Následne sa produkty zo 4 sekvenačných reakcií separujú elektroforeticky v 4 dráhach denaturačného polyakrylamidového gélu a po detekcii fragmentov sa určí sekvencia nukleotidov v analyzovanom úseku DNA.
V súčasnosti sa pri sekvenovaní na princípe Sangerovej metódy používajú hlavne termostabilné DNA polymerázy a asymetrická PCR, ktoré spolu s fluorescenčným značením ddNTP umožnili do značnej miery automatizáciu sekvenovania. Táto metóda je známa pod označením „dye-terminator cycle sequencing“. Pri tejto metóde prebieha sekvenačná reakcia v jednej skúmavke na princípe asymetrickej PCR. Okrem reakčných komponentov štandardnej asymetrickej PCR sa do reakcie pridáva malé množstvo ddNTP, pričom každý z nich je označený iným fluorescenčným farbivom. PCR reakciou vzniká súbor produktov s rôznou dľžkou, ktoré sú na 3´ konci označené inkorporovaným ddNTP so špecifickým fluorescenčným farbivom pre každý ddNTP. Po vyčistení PCR produktov od neinkorporovaných nukleotidov sa fragmenty denaturujú a analyzujú v automatických kapilárnych DNA sekvenátoroch, kde sa fragmenty pri vysokom napätí elektroforeticky separujú v kapiláre, naplnenej lineárnym polymérom. Na konci kapiláry sa prechádzajúce fragmenty ožiaria laserovým lúčom a emitovaný fluorescenčný signál z jednotlivých fluoroforov s rôznou vlnovou dĺžkou sa zaznamenáva CCD kamerou. Tento proces, spolu s vyhodnotením fluorescenčných signálov a priradením sekvencie k signálom prebieha automaticky, prostredníctvom „base-calling“ softvéru.
Záznam sekvencie v automatickom sekvenátore:
Uvedený spôsob sekvenovania prináša mnoho výhod oproti klasickej Sangerovej metóde. Okrem možnosti automatizácie, je to hlavne podstatne vyššia presnosť a rýchlosť sekvenovania, možnosť získať z jednej reakcie sekvenciu s dĺžkou až 1200 nukleotidov, malé množstvo templátu, potrebného do reakcie, ktorý nie je potrebné dôkladne purifikovať alebo sekvenovanie aj úsekov DNA s tendenciou k tvorbe sekundárnych štruktúr.
