Elektroforéza DNA I (agarózová) - Manuály
Elektroforetická
separácia a identifikácia nukleových kyselín v agarózovom géle
Chemikálie: roztok TBE (0,089 mol.l-1 Tris, 0,089 mol.l-1
kyselina boritá a 2,5 mmol.l-1 EDTA, pH=8,3), etídiumbromid (1 ug/ml),
nanášací roztok (30 % glycerol, 0,1 mol.l-1 EDTA a 0,25 % brómfenolová
modrá), agaróza, marker molekulových hmotností (napr. lambda DNA/Hind
III; 100 bp ladder), roztok DNA
Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, elektroforetické
zariadenie so zdrojom jednosmerného elektrického prúdu, UV
transiluminátor, rukavice
Postup:
1. prípravíme približne 2 % agarózový gél (50 ml): 1 g agarózy
rozpustíme v 50 ml roztoku TBE; zmes rozvaríme a po vychladnutí asi na
50 – 60 °C pridáme 25 ul etídiumbromidu (výsledná koncentrácia 0,5
ug/ml) POZOR, etídiumbromid je silný karcinogén a mutagén, pri práci
používaj rukavice!!!
2. roztok vylejeme na platňu s hrebeňom a necháme polymerizovať 15
min., po stuhnutí gélu opatrne odstránime hrebeň, gél vložíme do
elektroforetickej komory a zalejeme Tris – borátovým tlmivým roztokom
tak, aby roztok presahoval 1 mm nad gél.
3. k 10 ul vzorky DNA pridáme 2 ul nanášacieho roztoku a dôkladne
premiešame; nanášací roztok uľahčuje nanášanie a modré sfarbenie
umožňuje počas elektroforézy určiť dĺžku elektroforetického procesu.
4. zmes opatrne nanesieme do jamky v pripravenom géle, do jednej jamky
dáme 5 ul markera molekulových hmotností
5. po nanesení všetkých vzoriek do gélu elektroforetickú komoru
uzatvoríme a elektroforézu uskutočníme pri konštantnom napätí 130 V
počas 30 min
6. fragmenty DNA vizualizujeme na UV transiluminátore pri vlnovej dĺžke
UV svetla 302 nm 7. fragmenty DNA rôznej veľkosti (dĺžky) sa po
skončení elektroforézy nachádzajú v rôznej vzdialenosti od štartu
(jamky v géle), ich veľkosť porovnáme s markerom molekulových hmotností