Elektroforéza DNA I (agarózová) - Manuály

Elektroforetická separácia a identifikácia nukleových kyselín v agarózovom géle

Chemikálie: roztok TBE (0,089 mol.l-1 Tris, 0,089 mol.l-1 kyselina boritá a 2,5 mmol.l-1 EDTA, pH=8,3), etídiumbromid (1 ug/ml), nanášací roztok (30 % glycerol, 0,1 mol.l-1 EDTA a 0,25 % brómfenolová modrá), agaróza, marker molekulových hmotností (napr. lambda DNA/Hind III; 100 bp ladder), roztok DNA

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, elektroforetické zariadenie so zdrojom jednosmerného elektrického prúdu, UV transiluminátor, rukavice

Postup:
1. prípravíme približne 2 % agarózový gél (50 ml): 1 g agarózy rozpustíme v 50 ml roztoku TBE; zmes rozvaríme a po vychladnutí asi na 50 – 60 °C pridáme 25 ul etídiumbromidu (výsledná koncentrácia 0,5 ug/ml) POZOR, etídiumbromid je silný karcinogén a mutagén, pri práci používaj rukavice!!!
2. roztok vylejeme na platňu s hrebeňom a necháme polymerizovať 15 min., po stuhnutí gélu opatrne odstránime hrebeň, gél vložíme do elektroforetickej komory a zalejeme Tris – borátovým tlmivým roztokom tak, aby roztok presahoval 1 mm nad gél.
3. k 10 ul vzorky DNA pridáme 2 ul nanášacieho roztoku a dôkladne premiešame; nanášací roztok uľahčuje nanášanie a modré sfarbenie umožňuje počas elektroforézy určiť dĺžku elektroforetického procesu.
4. zmes opatrne nanesieme do jamky v pripravenom géle, do jednej jamky dáme 5 ul markera molekulových hmotností
5. po nanesení všetkých vzoriek do gélu elektroforetickú komoru uzatvoríme a elektroforézu uskutočníme pri konštantnom napätí 130 V počas 30 min
6. fragmenty DNA vizualizujeme na UV transiluminátore pri vlnovej dĺžke UV svetla 302 nm 7. fragmenty DNA rôznej veľkosti (dĺžky) sa po skončení elektroforézy nachádzajú v rôznej vzdialenosti od štartu (jamky v géle), ich veľkosť porovnáme s markerom molekulových hmotností