Elektroforéza DNA II (polyakrylamidová - PAGE) - Manuály

Elektroforetická separácia a identifikácia nukleových kyselín v polyakrylamidovom géle

Chemikálie: etanol, 30 % roztok akrylamid/bis (29 g akrylamidu s 1 g N,N´-metylén-bis-akrylamidu v objeme 100 ml), 10 % persíran amónny (APS), TEMED, elektródový tlmivý roztok (10,8 g Tris-HCl, 5,5 g kyselina trihydrogénboritá, 0,4 g EDTA v 1000 ml vody, pH=8,0), 10 x TBE (108 g Tris-HCl, 55 g kyselina trihydrogénboritá, 4 g EDTA v 1000 ml vody, pH=8,0), nanášací roztok (4,8 g močovina, 10 ml voda, 0,05 g brómfenolová modrá, 10 μl 10 mmol/l NaOH), 10 % kyselina octová, farbiaci roztok (2 g dusičnan strieborný, 3 ml 37 % formaldehyd v 1000 ml vody), vyvíjací roztok (50 g Na₂CO₃, 2000 ml vody, tesne pred použitím pridať 30 ml formaldehydu a 400 μl tiosíranu sodného s koncentráciou 10 mg/ml), redestilovaná voda, roztok DNA

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, zariadenie na vertikálnu elektroforézu so zdrojom jednosmerného elektrického prúdu a príslušenstvom, termoblok, kadičky, dokumentačný systém, nádoby na premývanie gélov

Postup:
1. sklenené platne dôkladne umyjeme teplou vodou s detergentom, opláchneme destilovanou vodou, etanolom a vysušíme; medzi sklá umiestnime tesnenia, celú sendvičovú zostavu spevníme svorkami a umiesnime do stojana
2. pripravíme 7 % gél zmiešaním 14,7 ml 30 % roztoku akrylamid/Bis, 3 ml 10 x TBE, 8,3 ml redestilovanej vody a 34 ml horúceho roztoku močoviny, pred nalievaním gélu pridáme 500 μl 10 % APS, a 50 μl TEMED
3. gél premiešame a nalejeme do priestoru medzi platne (lejeme po dlhšom skle) tak, aby nevrnikli bublinky a zasunieme hrebeň zubami smerom hore
4. gél necháme spolymerizovať 30 minút
5. po stuhnutí gélu opatrne vytiahneme hrebeň, povrch gélu prepláchneme destilovanou vodou
6. hrebeň jemne zasunieme zubami do gélu tak, aby sa ich hroty presne dotýkali okraja gélu; gél vyberieme zo stojana a umiestnime v elektroforetickej komore
7. do komory nalejeme elektródový tlmivý roztok
8. k 5 μl vzorky DNA pridáme nanášací roztok v pomere 1:0,8 a vzorky denaturujeme v termobloku pri 100°C počas 2 minút a potom ich okamžite prenesieme do ľadu
9. 5 μl vzorky naniesieme do jamiek v géle; do jednej jamky dáme marker molekulových hmotností
10. elektroforetickú komoru uzatvoríme a nastavíme napätie 2000 V
11. elektroforézu necháme prebiehať 3-5 hodín, kým farbička nedosiahne koniec gélu
12. po sklončení elektroforézy sklenenú platňu s gélom (gélom hore) ponoríme na 20 min. do 10 % kyseliny octovej za stáleho miešania pri laboratórnej teplote
13. gél premyjeme 2-3 krát v redestilovanej vode počas 5 minút
14. gél ponoríme na 30 min. do farbiaceho roztoku za stáleho miešania pri laboratórnej teplote
15. gél ponoríme na 10-15 sekúnd do vody za intenzívneho premývania
16. gél ponoríme do vyvíjacieho roztoku na 2-3 minúty
17. gél ponoríme na 30 min. do 10 % kyseliny octovej a necháme ho vysušiť v zvislej polohe pri laboratórnej teplote
18. gél zdokumentujeme a veľkosť jednotlivých fragmentov porovnáme s markerom molekulových hmotností. 

Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidovom géle (SDS-PAGE)

Chemikálie: etanol, 30 % roztok akrylamid/bis (29 g akrylamidu s 1 g N,N´-metylén-bis-akrylamidu v objeme 100 ml), 1,5 mol/l Tris-HCl (pH=8,8), 10 % SDS, 10 % persíran amónny (APS), TEMED, elektródový tlmivý roztok (3 g Tris-HCl, 14,1 g glycín, 1 g SDS v 1000 ml vody, pH=8,3), 10 % kyselina trichlóroctová, 0,5 % roztok Coomassie Brilliant Blue R-250 v etanole, nanášací roztok (187,5 mmol/l Tris-HCl, pH=6,8, 6 % SDS, 30 % glycerol, 0,03 % brómfenolová modrá), butanol, destilovaná voda, roztok proteínov, marker molekulových hmotností

Pomôcky: mikroskúmavky, mikropipety, zariadenie na vertikálnu elektroforézu so zdrojom jednosmerného elektrického prúdu a príslušenstvom, termoblok, kadičky, dokumentačný systém, nádoby na premývanie gélov

Postup:
1. sklenené platne dôkladne umyjeme teplou vodou s detergentom, opláchneme destilovanou vodou, etanolom a vysušíme; medzi sklá umiestnime tesnenia, celú sendvičovú zostavu spevníme svorkami a umiesnime do stojana
2. pripravíme 7,5 % deliaci gél zmiešaním 2,5 ml 30 % roztoku akrylamid/Bis, 100 μl 10 % SDS, 2,5 ml 1,5 mol/l Tris-HCl (pH=8,8) a 4,85 ml vody, pred nalievaním gélu pridáme 50 μl 10 % APS, a 5 μl TEMED
3. gél premiešame a nalejeme do priestoru medzi platne (lejeme po dlhšom skle) asi 1,5–3 cm (80 % celkovej veľkosti gélu) pod ich horný okraj; na vyrovnanie povrchu (hladiny) gélu nakvapkáme 3-5 kvapiek butanolu alebo vody
4. gél necháme spolymerizovať 1 hodinu
5. po stuhnutí gélu odstránime butanol (vodu) filtračným papierom (povrch gélu vysušíme) a medzi platne zasunieme hrebeň do výšky asi 0,5-1 cm nad deliaci gél; hrebeň na jednej strane nadvihneme, aby sme vytvorili priestor pre nalatie štartovacieho gélu
6. pripravíme 4 % štartovací gél zmiešaním 1,3 ml 30 % roztoku akrylamid/Bis, 100 μl 10 % SDS, 2,5 ml 1,5 mol/l Tris-HCl (pH=8,8) a 6,1 ml vody, pred nalievaním gélu pridáme 50 μl 10 % APS, a 10 μl TEMED
7. gél premiešame a nalejeme nad deliaci gél cez priestor medzi platňami a hrebeňom; po naliatí hrebeň umiestnime do správnej polohy a gél necháme spolymerizovať (10 min.)
8. po stuhnutí gélu opatrne vytiahneme hrebeň, jamky prepláchneme destilovanou vodou, gél vyberieme zo stojana a umiestnime v elektroforetickej komore
9. do komory nalejeme elektródový tlmivý roztok
10. vzorky proteínov pred elektroforézou zmiešame s nanášacím roztokom v pomere 4:1, inkubujeme 4 minúty pri 95°C 10. 5-10 μl vzorky naniesieme do jamiek v géle; do jednej jamky dáme marker molekulových hmotností
11. elektroforetickú komoru uzatvoríme a nastavíme konštantný prúd 30 mA (elektroforéza bude najskôr prebiehať pri menšom prúde, postupne sa bude prúd zvyšovať)
12. elektroforézu necháme prebiehať 6-10 hodín, kým farbička nedosiahne koniec deliaceho gélu
13. po sklončení elektroforézy gél inkubujeme 6-12 hodín vo farbiacom roztoku pozozostávajúcom z 95 ml 10 % kyseliny trichlóroctovej a 5 ml 0,5 % roztoku Coomassie Brilliant Blue R-250
14. farbivo z gélu odstránime premývaním gélu v destilovanej vode počas 12-24 hodín
15. gél osušíme, zdokumentujeme a veľkosť jednotlivých frakcií porovnáme s markerom molekulových hmotností