Fragmentačná STR analýza - popis metódy
Fragmentačná analýza DNA je, podobne ako automatické sekvenovanie DNA, založená na amplifikácii DNA pomocou PCR, následnej kapilárnej elektroforéze naamplifikovaných úsekov a detekcii fluorescenčne značených fragmentov. Na rozdiel od sekvenovania, kde sa pomocou asymetrickej PCR produkujú jednovláknové úseky DNA s dĺžkami, odlišujúcimi sa o 1 nukleotid, na základe ktorých sa určí kompletné poradie báz v sekvenovanej DNA, pri fragmentačnej analýze nás nezaujíma konkrétna sekvencia naamplifikovanéhu úseku ale len jeho dĺžka. Fragmentačná analýza nachádza široké uplatnenie pri identifikácii tzv. mikrosatelitov - krátkych opakujúcich sa sekvencií (z angličtiny short tandem repeats - STR). Analýza mikrosatelitov sa využíva napr. pri identifikácii jedincov alebo genetickom mapovaní a úspešne sa aplikuje v medicíne a kriminalistike pri určovaní rodičovstva a identifikácií osôb, ako aj pri štúdiu biodiverzity a ochrane živočíšnych genetických zdrojov, kde sa stala štandardným postupom.
Pri uvedených aplikáciách sa úsek DNA, obsahujúci mikrosatelit, najskôr amplifikuje štandardnou PCR, pričom sa využívajú primery, z ktorých jeden je označený fluorescenčnou farbičkou. V praxi sa často analyzuje a tým amplifikuje viac lokusov v jednej reakcii (tzv. multiplex PCR) s viacerými dvojicami primerov, ktoré sú označené rôznymi fluorescenčnými farbivami pre jednotlivé lokusy (napr. farbivá FAM, VIC, NED, PET). Rôzne značenie umožňuje následnú automatickú analýzu prítomných alel daného lokusu na kapilárnych sekvenátoroch. Spoločne s každou vzorkou je v analyzovanej zmesi prítomný veľkostný štandard - súbor fragmentov so známou dĺžkou, ktorý umožňuje presné stanovenie dĺžky jednotlivých naamplifikovaných fragmentov. Detekcia jednotlivých píkov a stanovenie dĺžky fragmentov sa realizuje pomocou softvéru, ktorý je súčasťou softvérového vybavenia ku kapilárnej elektroforéze.
Záznam fragmentačnej analýzy STR sekvencií:
