Sekvenovanie DNA - manuály

Stanovenie sekvencie úseku DNA naamplifikovaného pomocou PCR

Anotácia: Sekvenovanie DNA sa využíva v rámci širokej palety aplikácií, ako je stanovenie neznámej sekvencie DNA, identifikácia genetických veriantov (SNP, CNV) a mutácií, epigenetické analýzy a pod. Sekvenovať možno rôzne templáty, napr. DNA včlenenú a naklonovanú vo vektore, genómovú DNA alebo PCR produkt. V rámci experimentu stanovíme sekvenciu DNA, naamplifikovanej pomocou PCR reakcie (PCR produktu). Na sekvenovanie využijeme komerčne dostupnú súpravu (http://www.thermofisher.com), ktorá umožňuje realizáciu sekvenačnej reakcie. Jej produkty sa následne separujú kapilárnou elektroforézou s presným určením sekvencie daného úseku DNA.

Chemikálie a materiál: Komerčná sekvenačná súprava - sekvenačný reakčný roztok (2,5x), sekvenačný tlmivý roztok (5x), špecifický primer (forward), kontrolná DNA; komerčná súprava pre čistenie PCR produktov (http://www.affymetrix.com), 125 mM EDTA (pH=8,0), 100% a 70% etanol, Hi-Di Formamid, 10 x tlmivý roztok pre genetický analyzátor, polymér (POP-6), vzorky sekvenovanej DNA - PCR produkty

Pomôcky a vybavenie: termocykler, genetický analyzátor (kapilárna elektroforéza) s príslušenstvom a kapilárou, inkubátor, vákuová sušiareň alebo lyofilizátor, pipety, mikroskúmavky, špičky, rukavice

Postup:
1. Vzorky DNA pre sekvenovanie - v našom prípade PCR produkty pred analýzou prečistíme pomocou komerčnej súpravy pre čistenie PCR produktov. Zmiešame 5 µl PCR produktu s 2 µl reakčného roztoku súpravy a inkubujeme 15 min. pri 37°C. Následne inkubujeme 15 min. pri 80°C. PCR produkt má teraz vhodnú kvalitu pre použitie v sekvenačnej reakcii.
2. Zmeriame koncentráciu DNA v PCR produkte pomcou spektrofotometra na základe absorbancie vzorky pri 260 nm podľa manuálu k prístroju. Na základe získanej hodnoty vypočítame objem PCR produktu (príp. riedenie), ktorý sa použije v sekvenačnej reakcii. Množstvo PCR produktu pre sekvenačnú reakciu závisí od veľkosti PCR fragmentov nasledovne: 100–200 bp = 1–3 ng; 200–500 bp = 3–10 ng; 500–1000 bp = 5–20 ng; 1000–2000 bp = 10–40 ng; >2000 bp = 20–50 ng.
3. Pripravíme si reakčnú zmes pre sekvenačnú PCR reakciu. Reakcia bude prebiehať v celkovom objeme 20 µl. Reakčná zmes pozostáva s nasledovných komponentov:

reagent	objem na 1 vzorku
sekvenačný reakčný roztok (2,5 x)	4 µl
sekvenačný tlmivý roztok (5x)	2 µl
špecifický primer (10 pmol/µl)	0,3 µl
templátová DNA (pozri časť 2)	5 µl
deionizovaná voda	8,7 µl

Pri analýze viacerých vzoriek jednotlivé zložky (okrem templátovej DNA) zmiešame v potrebných množstvách, rozpipetujeme do skúmaviek a nakoniec do každej skúmavky pridáme príslušný objem roztoku templátovej DNA (jednotlivé vzorky). Do jednej skúmavky dáme kontrolnú DNA (súčasť komerčnej súpravy).
4. Uskutočníme sekvenačnú reakciu. Skúmavky umiestnime do termocyklera s nasledovným programom (požadovaný ramping medzi teplotami je 1 °C/s.):
• denaturácia 1 min. pri 96 °C
• 25 x (denaturácia 10 s. pri 96 °C; annealing 5 s. pri 50 °C; polymerizácia 4 min. pri 60 °C)
• zníženie teploty na 4 °C.
5. Produkty sekvenačnej reakcie prečistíme. Do skúmaviek s produktmi sekvenačnej reakcie (20 µl) pridáme 5 µl roztoku EDTA a 60 µl 100% etanolu. Premiešame otočením skúmaviek 4x a necháme inkubovať pri izbovej teplote 15 min. Centrifugujeme 45 min. pri 1400–2000 x g alebo 30 min. pri 2000–3000 x g. Supernatant zlejeme a pelet premyjeme 60 µl 70% etanolu. Centrifugujeme pri 4 °C 15 min. pri 1650 x g. Supernatant zlejeme a pelet vysušíme vo vákuovej sušiarni alebo lyofilizátore 10-15 min.
6. Elektroforézu produktov sekvenačnej reakcie uskutočníme na genetickom analyzátore. Pred začiatkom je potrebné sa uistiť, či softvér ku genetickému analyzátoru je nakalibrovaný k použitiu danej komerčnej súpravy (obsahuje nainštalovaný tzv. matrix pre fluorescenčné farbičky, obsiahnuté v rámci použitej komerčnej súpravy). 
7. Do každej skúmavky s vysušenou DNA (vzorky aj kontrolná DNA) pridáme 10 µl Hi-Di formamidu.
8. Skúmavky umiestnime do genetického analyzátora podľa inštrukcií výrobcu prístroja. Dbáme na to, aby sme pri nastavení behu elektroforézy použili správny matrix, modul behu elektroforézy a protokol.
9. Výsledky elektroforézy vyhodnotíme s použitím príslušného softvéru, čím získame sekvenciu analyzovaného úseku DNA.