Reverzná transkripcia - manuály
Reverzná transkripcia vychádza z RNA, ktorá bola vyizolovaná z biologického materiálu.
Chemikálie: DEPC-voda, deionizovaná voda, 10x konc. PCR tlmivý roztok, 50 mmol.l-1 MgCl2, 10 mmol.l-1 dNTP, RNase inhibítor (20 U/µl), oligo (dT)16 primer, MuLV-reverzná transkriptáza (50 U/µl), vyizolovaná RNA
Pomôcky: mikropipety, RNase-free skúmavky (1,5 a 0,2 ml) a špičky, termocykler, termoblok, rukavice
Postup:
1. do 0,2 ml skúmavky pripravíme reakčný roztok: 2 µl
10x PCR roztoku, 4 µl 50 mmol.l-1 MgCl2,
8 µl 10 mmol.l-1 dNTP, 1 µl
RNase inhibítor, 1 µl oligo dT primer, 1 µl MuLV reverzná
transkriptáza, 1 µg denaturovanej (zahriatej na 70 °C) RNA v 3-5 µl
DEPC-vody
2. skúmavky umiestnime do termocyklera a spustíme program (10 min pri
25 °C, 15 min pri 42 °C, 5 min pri 99 °C, 5 min pri 4 °C)
3. skúmavky s cDNA je možné skladovať pri -20 °C alebo alikvotnú časť
použiť ihneď na amplifikáciu v RT-PCR alebo real-time PCR.
