Real-time PCR - popis metódy

Real-time polymerázová reťazová reakcia (real-time PCR) sa využíva na stanovenie množstva nukleovej kyseliny. Metóda umožňuje stanoviť počiatočné množstvá templátu na základe priebežného sledovania prírastku produktu po každom PCR cykle - teda v „reálnom čase“ tvorby produktu. 

Kontinuálne meranie pribúdajúceho PCR produktu je založené na jeho fluorescenčnom označení v priebehu reakcie a uskutočňuje sa v špeciálnych real-time PCR termocykleroch. Na fluorescenčné označenie PCR produktu sa používajú:
A) fluorescenčné farbivá, ktoré sa špecificky viažu na dsDNA
B) fluorescenčne označené hybridizačné sondy
C) fluorescenčne označené primery
V praxi sa najčastejšie využívajú prvé dva spôsoby.

Značenie PCR produktu fluorescenčnými farbivami
Princípom tejto metódy je naviazanie fluorescenčného farbiva do dvojvláknovej DNA počas PCR reakcie. V súčasnosti sa najčastejšie používajú farbivá typu SYBR Green I a jeho modifikácií (napr. SYBR Green ER). Tieto farbivá majú veľmi nízku fluorescenciu v nenaviazanom stave, ktorá sa po väzbe na dsDNA zvyšuje až 1000x. Fluorescenčný signál sa zaznamenáva najčastejšie na konci polymerizačného kroku každého cyklu PCR (po skončení elongácie), alebo kontinuálne. V detekčnom systéme so SYBR Green I emituje fluorescenčný signál každá dsDNA molekula. Preto je tento systém vysoko univerzálny, jednoduchý, a je ho možné použiť s ľubovoľnými primermi. Jeho nevýhodou však je, že zaznamenávaný signál obsahuje aj fluorescenciu z nešpecifických produktov PCR reakcie a z primer-dimérov. Pred vyhodnotením výsledkov z PCR je preto potrebné overiť neprítomnosť nešpecifických PCR produktov v ukončenej reakcii analýzou krivky topenia. 

Fluorescenčne značené hybridizačné sondy
Táto metóda je založená na hybridizácii špecifického, fluorescenčne označeného oligonukleotidu s PCR produktom. Fluorescenčný signál sa v tomto prípade generuje trochu zložitejšie. Využíva sa spektroskopický proces prenosu energie medzi dvomi fluoroformi alebo medzi fluoroforom a zhášačom, označovaný ako FRET (fluorescence resonance energy transfer). Tento proces prebieha iba vtedy, ak sú oba fluorofory (alebo fluorofor a zhášač) v blízkej vzdialenosti a majú prekrývajúce sa absorbčné a emisné spektrá. Príkladom detekčného systému na princípe FRET sú hybridizačné sondy TaqMan. Sú to oligonukleotidy komplementárne s vnútornou sekvenciou sledovaného PCR produktu. Na 5´ konci obsahujú naviazané reportérové florescenčné farbivo (napr. FAM, VIC, NED, TET) a na 3´ konci sa nachádza zhášač. Zhášač môže byť fluorescenčný, napr. TAMRA, alebo nefluorescenčný (DABCYL, Black Hole Quencher a pod.). V nehybridizovanom oligonukleotide je malá vzdialenosť medzi fluorescenčným farbivom a zhášačom, ktorá blokuje flourescenciu v dôsledku FRET. Po hybridizácii sondy s vláknami pribúdajúceho PCR produktu sa v elongačnom kroku pôsobením 5´ exonukleázovej aktivity Taq polymerázy sonda od 5´konca hydrolyzuje, čím sa fluorescenčné farbivo vzdiali od zhášača a začne emitovať fluorescenciu. Fluorescencia sa v každom cykle zvyšuje úmerne s pribúdajúcim PCR produktom. 

Na nasledujúcom obrázku sú znázornené krivky závislosti fluorescencie od počtu cyklov v real-time PCR.

Samotné stanovenie počiatočného množstva (koncentrácie) molekúl sa realizuje analýzou uvedených kriviek. Prvé významné zvýšenie množstva PCR cez tzv. prah detekcie (threshold) koreluje s množstvom templátu DNA a vyjadruje sa počtom cyklov pri prekročení prahu detekcie C_t. Kvantifikácia v real-time PCR môže byť:
- absolútna – zisťuje sa presný počet molekúl DNA, RNA pred amplifikáciou; napr. množstvo baktérií, vírusov, CNVs...; pre porovnanie vyžaduje štandard so známou koncentráciou
- relatívna – porovnáva množstvo DNA, RNA medzi vzorkami; napr. expresiu génov v rôznych tkanivách; pre porovnanie vyžaduje referenčný gén so stálou expresiou (tzv. referenčné - housekeeping-ové gény, napr. Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, Beta-aktin, RPLP0...)