Izolácia RNA - popis metódy

V eukaryotickej bunke sa nachádza niekoľko typov RNA s rôznou funkciou a s rôznymi veľkosťami. Okrem hnRNA a mRNA, ktoré môžu mať dĺžku 10-15 kb sa v bunkách nachádza veľké množstvo ribozomálnych RNA (28S, 18S a 5S) a tRNA s veľkosťou od 0,1 kb až do 5 kb. Experimenty s RNA umožňujú sledovať a porovnávať expresiu génov (Northern blotting, RT-PCR, real-time PCR, expresné microarrays), klonovať gény (cDNA) alebo regulovať expresiu génov (antisense RNA, RNA interferencia). V uvedených typoch experimentov sa najčastejšie využíva mRNA, buď purifikovaná, zbavená ostatných typov RNA, alebo v zmesi tzv. celkovej RNA bunky.

Pri práci s RNA je veľmi dôležité blokovať aktivitu RNA degradačných enzýmov, ribonukleáz (RNáz). Inhibíciu aktivity endogénnych RNáz zvyčajne zabezpečuje okamžité spracovanie vzorky biologického materiálu po odbere v lyzačnom roztoku s inhibičným účinkom na RNázy (guanidín izotiokyanát, fenol) alebo v prípade odberu vzorky v teréne, jej okamžité zmrazenie v tekutom dusíku alebo uloženie do špeciálnych skladovacích roztokov, napr. RNAlater. Rovnako dôležité je však zabránenie kontaminácie spracovávanej vzorky RNázami z roztokov, laboratórneho skla, plastov, ako aj z potu rúk experimentátora. Preto je nevyhnutné pri práci s RNA vždy používať ochranné latexové rukavice a laboratórne pomôcky zbavené RNáz. Kompletná inhibícia aktivity RNáz je pomerne náročná, pretože RNázy sú mimoriadne termostabilné enzýmy (zachovávajú si aktivitu aj po autoklávovaní pri 121°C), sú aktívne v širokom rozsahu pH a nevyžadujú k svojej aktivite prítomnosť kofaktorov. Práca s RNA teda vyžaduje dôkladnú prípravu roztokov a iného laboratórneho vybavenia, ako sú skúmavky, pipety a pod. Najvhodnejšie je používať plastový materiál určený na túto prácu, tzv. RNase-free, prípadne opláchnuť všetky pomôcky po autoklávovaní chloroformom. Aj napriek použitiu komerčných súprav a lyzačných roztokov na izoláciu RNA (RNAeasy, Trizol, RNAzol a pod.) sa nevyhneme príprave niektorých roztokov v laboratóriu. V takom prípade používame na ich prípravu vždy iba deionizovanú alebo destilovanú vodu opracovanú s DEPC (dietyl pyrokarbonát) a autoklávovanú. Pri následnej manipulácií s RNA v enzýmových reakciách sa ako účinný inhibítor RNáz používa rekombinantný alebo natívny proteín RNase inhibitor. Pri izolácií RNA sa na lýzu buniek a denaturáciu proteínov používajú viaceré kombinácie detergentov (SDS) a fenolu, fenolu s chloroformom, alebo chaotropných zlúčenín guanidín tiokyanátu a fenolu, ktoré účinne lyzujú bunky alebo tkanivá a zároveň inhibujú RNázy. Komerčný preparát TRIZOL (Invitrogen, USA) je založený práve na kombinácií fenolu a guanidín tiokyanátu. Po rozrušení tkaniva sa pridaním chloroformu vytvoria dve fázy, vodná a organická a RNA sa z organickej fázy vyzráža izopropanolom.

Podobne ako v prípade izolácie DNA, v súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie RNA z rôznych zdrojov. Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu RNA z konkrétneho zdroja s vysokou účinnosťou.