Real-time PCR - manuály

Stanovenie expresie génu pre leptín v tukovom tkanive a pečeni ošípanej

Anotácia: Leptín zohráva dôležitú úlohu v procesoch energetického metabolizmu a prijmu potravy, čím ovplyvňuje hmotnosť a zloženia tela. V experimente budeme porovnávať úroveň expresie génu pre leptín (LEP) v rôznych tkanivách ošípanej, čiže množstvá mRNA leptínového génu. Aby sme sa vyhli nepresnostiam, spojeným s prípravou vzoriek a reakcií (napr. pri pipetovaní), ktoré môžu ovplyvniť množstvo mRNA, zistené množstvá budeme vzťahovať k referenčnému génu GAPDH (glyceraldehyd-fosfát dehydrogenáza).

Chemikálie: SYBR Green Mix (obsahuje reakčný tlmivý roztok, dNTPs, MgCl², Taq DNA polymerázu, farbičku SYBR Green), primery LEPF a LEPR (10 pmol/μl), primery GAPDH-F a GAPDH-R (10 pmol/μl), sterilná redestilovaná voda, roztok vyizolovanej mRNA z tukového tkaniva a z pečene a prepísanej procesom reverznej transkripcie do cDNA

Pomôcky: mikroskúmavky (0,2 ml kompatibilné k real-time PCR termocykleru), mikropipety, real-time PCR termocykler, PCR sterilný box, rukavice

Postup:
1. Pred uskutočnením real-time PCR je potrebné uskutočniť izoláciu RNA zo vzoriek tukového tkaniva a pečene a následne ju podrobiť reverznej transkripcii.
2. V PCR boxe pripravíme reakčnú zmes real-time PCR pre stanovený počet vzoriek podľa tabuľky; výsledný objem reakčnej zmesi je 20 μl. 

reagent	koncentrácia	objem na 1 vzorku	objem na ... vzoriek
redestilovaná sterilná voda	-	7,8 ul
SYBR Green Mix (2x)	1x	10,0 ul
primer 1 (10 pmol/ul)	0,5 umol/l	1,0 ul
primer 2 (10 pmol/ul)	0,5 umol/l	1,0 ul
cDNA	20-50 ng	0,2 ul

Separátne pripravíme reakčnú zmes s primermi LEPF a LEPR a zmes s primermi GAPDH-F a GAPDH-R, pričom namiešeme výsledné objemy tak, aby sme každú vzorku analyzovali pre každý gén 3x (v rámci analýzy dát sa údaje priemerujú). Jednotlivé zložky (okrem cDNA) zmiešame v potrebných množstvách, rozpipetujeme do 0,2 ml skúmaviek a nakoniec do každej skúmavky pridáme 0,2 μl cDNA (jednotlivé vzorky).
3. Skúmavky umiestnime do real-time termocyklera s nasledovným programom:
• Denaturácia 5 min. pri 94 °C
• 45 x (denaturácia 30s. pri 94 °C; annealing 30s. pri 61 °C; polymerizácia 30s. pri 72 °C)
• Polymerizácia 5 min. pri 72 °C.
4. Po skončení reakcie uskutočníme analýzu dát:
• overíme kvalitu amplikónu prostredníctvom krivky topenia 
• skontrolujeme priebeh fluorescenčných kriiek a nastavenie prahu detekcie (threshold) 
• vyhodnotíme hodnoty C_t
• uskutočníme výpočet rozdielu v expresii LEP génu medzi tukovým tkanivom a pečeňou pomocou vybranej hodnotiacej metódy (napr. Livak metódy)