DNA / expresné / proteínové microarrays - MANUÁLY
Detekcia zmien expresie génov po expozícii toxickou látkou pomocou technológie microarrays
Anotácia: Bunky reagujú na podnety z okolia vrátane pôsobenia toxických látok zmenou expresie niektorých génov. Na skríning génov, ktorých expresia sa zmenila, možno využiť technológiu microarrays (expresné čipy), kde v rámci jednej reakcie je možné analyzovať tisíce génov súčasne. V našom experimente na detekciu zmien expresie génov využijeme expresný čip GE 4x44K (http://www.agilent.com) a súpravy chemikálií pre dvojfarbičkovú metódu značenia a analýzy. Na analýzu využijeme RNA, vyizolovanú z kultivovaných buniek – zo skupiny buniek, ktorá bola exponovaná toxickou látkou (vzorka A) a kontrolnej skupiny buniek (bez expozície, vzorka B).
Chemikálie a materiál: komerčné súpravy pre prípravu a dvojfarbičkové značenie cRNA, prípravu kontrolných „Spike“ roztokov a hybridizáciu cRNA (http://www.agilent.com), obsahujúce roztoky „Spike A“ a „Spike B“, riediaci tlmivý roztok, T7 Primer mix, 5× RT tlmivý roztok, DTT (0,1 M), dNTP (10 mM), enzymatickú zmes, 5× transkripčný tlmivý roztok, T7 RNA polymerázovú enzymatickú zmes, Cyanine 3-CTP (Cy3) a Cyanine 5-CTP (Cy5), 10× blokovacie činidlo, 25x fragmentačný roztok, 2× Hi-RPM hybridizačný roztok, premývacie tlmivé roztoky 1 a 2, Triton X-102 (10 %), stabilizačný roztok; RNase/DNase-free sterilná voda; acetonitril; izopropanol; RNeasy Mini Kit (Qiagen); ľad; vyizolovaná RNA
Pomôcky a vybavenie: microarray skener, microarray čip s tesniacim sklíčkom, hybridizačná komôrka, inkubátor, vodný kúpeľ, centrifúga, vortex, spektrofotometer, hybridizačná piecka, magnetická miešačka s miešadielkami, stojan na sklíčka, pipety, farbiace nádoby na premývanie, špičky, rukavice, mikroskúmavky 1,5 ml.
Postup:
1. Na analýzu potrebujeme vyizolovanú RNA (celková RNA alebo poly-A
RNA) zo vzoriek, v ktorých chceme porovnať expresiu génov - v našom
experimente ide o celkovú RNA z kultivovaných exponovaných buniek
(vzorka A) a kontrolnej skupiny buniek (bez expozície, vzorka B). Na
izoláciu využijeme niektorý z dostupných postupov alebo komerčných
súprav. Pre úspešný priebeh analýzy potrebujeme aspoň 10 - 200 ng
celkovej RNA alebo min. 5 ng poly-A RNA.
2. Pripravíme si kontrolné roztoky „Spike A“ a „Spike B“. Tieto roztoky
obsahujú súbory transkriptov - pozitívnych kontrol, ktoré prejdú
všetkými krokmi od značenia nukleovej kyseliny až po skenovanie a
vyhodnotenie. Umožnia porovnanie dát analyzovaných transkriptov (zo
vzoriek) s dátami kontrolných transkriptov so známou koncentráciou a
vzájomnými pomermi, čím sa zvýši presnosť analýzy. Skúmavky s
jednotlivými zásobnými roztokmi najskôr inkubujeme 5 min. pri 37 °C vo
vodnom kúpeli a roztoky následne riedime sterilnou vodou. Ak množstvo
vyizolovanej RNA je 25 ng, riedenie uskutočníme nasledovne: Spike A
roztok inkubujeme 5 min. pri 37 °C a zvortexujeme a krátko
centrifugujeme. 2 μl roztoku napipetjeme do novej 1,5 ml skúmavky a
pridáme 38 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:20). V ďalšom
riedení zmiešame 2 μl roztoku z prvého riedenia a 78 μl riediaceho
tlmivého roztoku (riedenie 1:40). V treťom riedení zmiešame 2 μl
roztoku z druhého riedenia a 30 μl riediaceho tlmivého roztoku
(riedenie 1:16). V poslednom riedení zmiešame 4 μl roztoku z tretieho
riedenia a 28 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:8). Riedením
získame celkovo 102 400-krát zriedený roztok. 2 μl takto zriedeného
Spike A roztoku zmiešame s 1,5 μl celkovej RNA (25 ng) zo vzorky A
(exponovaná). Podobne uskutočníme riedenie Spike B roztoku a 2 μl takto
zriedeného roztoku zmiešame s 1,5 μl celkovej RNA (25 ng) zo vzorky B
(kontrolná). Výsledkom tohto kroku sú dve 1,5 ml skúmavky s RNA vzorky
A a Spike A mixom (3,5 μl), resp. RNA zo vzorky B so Spike B mixom (3,5
μl). Ak množstvo vyizolovanej RNA je iné ako 25 ng, riedenie
uskutočníme podľa manuálu ku Spike kitu pre príslušnú koncentráciu RNA.
3. Do každej z 1,5 ml skúmaviek z predchádzajúceho kroku pridáme 1.8 μl
T7 Primer mixu, obsah zdenaturujeme inkubáciou 10 min. pri 65 °C vo
vodnom kúpeli a skúmavky vložíme do ľadu na 5 min. Výsledný objem v
každej
skúmavke bude 5,3 μl.
4. Uskutočníme reverznú transkripciu RNA do cDNA. V 1,5 ml skúmavke
pripravíme cDNA reakčnú zmes - zmiešame 4 μl 5× RT tlmivého roztoku
(ktorý pred použitím predhrejeme 3-4 min. pri 80°C), 2 μl DTT (0,1 M),
1 μl dNTP (10 mM) a 2,4 μl enzymatickej zmesi. Do každej z 1,5 ml
skúmaviek z predchádzajúceho kroku pridáme 4,7 μl pripravenej cDNA
reakčnej zmesi a skúmavky inkubujeme 2 hod. pri 40 °C, potom 15 min.
pri 70 °C a napokon 5 min. na ľade. Výsledný objem v každej skúmavke
bude 10 μl.
5. V ďalšom kroku uskutočníme transkripciu cDNA do cRNA so súčasným
zabudovaním fluorescenčných farbičiek Cyanine 3-CTP (Cy3) a Cyanine
5-CTP (Cy5). V jednej 1,5 ml skúmavke pripravíme transkripčnú reakčnú
zmes pre vzorku A - zmiešame 0,75 μl sterilnej vody, 3,2 μl 5×
transkripčného tlmivého roztoku, 0,6 μl DTT (0,1 M), 1 μl NTP mixu,
0,21 μl T7 RNA polymerázovej enzymatickej zmesi a 0,24 μl Cyanine
3-CTP. V druhej 1,5 ml skúmavke pripravíme transkripčnú reakčnú zmes
pre vzorku B - zmiešame všetky komponenty v rovnakých objemoch ako pre
vzorku A s rozdielom farbičky – namiesto Cyanine 3-CTP do zmesi pridáme
0,24 μl Cyanine 5-CTP. Celý objem transkripčnej reakčnej zmesi zo
skúmavky s Cyanine 3-CTP (6 μl) zmiešame s obsahom skúmavky s cDNA zo
vzorky A so Spike A mixom z predchádzajúceho kroku. Celý objem
transkripčnej reakčnej zmesi zo skúmavky s Cyanine 5-CTP (6 μl)
zmiešame s obsahom skúmavky s cDNA zo vzorky B so Spike B mixom z
predchádzajúceho kroku. Výsledný objem v každej skúmavke bude 16 μl.
Skúmavky inkubujeme 2 hod. pri 40°C.
6. Zmesi z obidvoch skúmaviek prečistíme pomocou niektorého z
dostupných komerčných kitov, napr. „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) alebo
„Absolutely RNA Nanoprep Kit“ (Agilent). Postupujeme podľa manuálov k
jednotlivým kitom. Po prečistení by sme mali získať 30 μl roztoku cRNA
v každej skúmavke (tzv. elučný objem).
7. Pred uskutočnením
hybridizácie je potrebné zmerať množstvo získanej cRNA a jej kvalitu
pomocou spektrofotometra. Pri meraní množstva a kvality RNA postupujeme
podľa odporúčaní výrobcu prístroja. Meraním získame nasledovné
parametre: koncentráciu Cyanine 3 alebo Cyanine 5 (pmol/μl), pomer
absorbancií pre RNA (260 nm/280 nm), koncentráciu RNA (ng/μl). Z
uvedených parametrov vypočítame tzv. špecifickú aktivitu (pmol Cy3
alebo Cy5 / μg cRNA) a výťažok (μg) cRNA nasledovne:
((koncentrácia Cy3 alebo Cy5) / (koncentrácia cRNA)) x 1000 = pmol Cy3
alebo Cy5 / μg cRNA
((koncentrácia cRNA) x 30 μl (elučný objem)) / 1000 = μg cRNA
Pre využitie získanej cRNA v ďalšej analýze je potrebné, aby hodnota
špecifickej aktivity bola ≥ 6 pmol Cy3 alebo Cy5 / μg cRNA a výťažok
dosiahol aspoň 0,825 μg cRNA pre 4-políčkový formát microarray sklíčka
(pre iné formáty sa vyžaduje iný výťažok cRNA podľa manuálu k
microarray).
8. Pripravíme vzorky pre hybridizáciu na microarray čipe. Pridáme 500
μl sterilnej vody do skúmavky s lyofilizovaným 10× koncentrovaným
blokovacím činidlom a vortexujeme. V 1,5 ml skúmavke zmiešame 825 ng
cRNA označenej s Cy3 (vzorka A z bodu 5), 825 ng cRNA označenej s Cy5
(vzorka B z bodu 5), 11 μl roztoku blokovacieho činidla a doplníme
sterilnou vodou do 52,8 μl. Do zmesi pridáme 2,2 μl 25x koncentrovaného
fragmentačného roztoku a premiešame (celkový objem v skúmavke bude 55
μl). Uvedené množstvá sú potrebné pre hybridizáciu na jednom políčku
4-políčkového formátu microarray sklíčka (pre iné formáty sa vyžadujú
iné množstvá jednotlivých komponentov podľa manuálu k microarray). Zmes
inkubujeme presne 30 min. pri 60 °C, čím sa RNA fragmentuje. Následne
zmes ochladíme na ľade 1 min. Do skúmavky potom pridáme rovnaký objem
(55 μl) 2× koncentrovaného Hi-RPM hybridizačného roztoku, čím sa
fragmentačná reakcia zastaví. Zmes jemne premiešame pipetou bez
vytvorenia bubliniek. Skúmavku krátko scentrifugujeme, uložíme na ľad a
čo najrýchlejšie uskutočníme hybridizáciu na sklíčku.
9. Uskutočníme hybridizáciu značenej a fragmentovanej cRNA na
microarray čipe. Vložíme tesniace sklíčko do komôrky štítkom nahor,
zarovno s obdĺžnikovým profilom komôrky. Opatrne napipetujeme vzorku z
predchádzajúceho bodu do priestoru jedného zo štyroch políčok tak, aby
sa nevytvorili bublinky. 4-políčkové sklíčko je určené pre realizáciu
štyroch analýz, preto do zvyšných troch políčok môžeme napipetovať
ďalšie vzorky z iných experimentov. Komôrku opatrne prikryte microarray
sklíčkom jeho aktívnou stranou nadol (aby číselný čiarový kód na
sklíčku smeroval nahor). Komôrku so sklíčkami následne prikryjeme
krycou časťou a pritiahneme skrutkovou svorkou. Komôrku vertikálne
pootáčame, čím navlhčíme obsah políčok a posúdime pohyb vzduchových
bublín. Komôrku umiestnime do rotačnej časti (rotátora) hybridizačnej
komory (piecky). Rotačnú rýchlosť rotátora nastavíme na 10 rpm, teplotu
komory na 65 °C a čipy necháme hybridizovať 17 hod.
10. Čip premyjeme v dvoch premývacích tlmivých roztokoch 1 a 2 (sú
súčasťou kitu), do ktorých pred použitím pridáme Triton X-102 (10 %) do
výslednej koncentrácie 0,005 %. Všetko laboratórne vybavenie, používané
na premývanie – farbiace nádoby, stojany na sklíčka, miešadielka atď.,
pred použitím očistíme v acetonitrile (tie, ktoré boli vystavené
stabilizačnému roztoku, pozri ďalej) alebo v izopropanole (ostatné
vybavenie) a opláchneme sterilnou vodou. Pripravíme si tri farbiace
nádoby: prvú nádobu naplníme premývacím tlmivým roztokom 1; do druhej
nádoby vložíme stojan na sklíčka a magnetické miešadielko, nádobu
umiestnime na magnetickú miešačku a nádobu naplníme premývacím tlmivým
roztokom 1; tretiu nádobu neskôr naplníme premývacím tlmivým roztokom
2, zahriatym na 37 °C. Po vytiahnutí komôrky s čipom z hybridizačnej
piecky komôrku opatrne rozoberieme a spojené microarray sklíčko s
4-políčkovým sklíčkom ponoríme do prvej nádoby s premývacím tlmivým
roztokom 1. V roztoku opatrne oddelíme microarray sklíčko od
4-políčkového sklíčka a microarray sklíčko premiestnime do stojana na
sklíčka v druhej nádobke s premývacím tlmivým roztokom 1. Premiešavame
1 min. pri nastavení rotácie miešadielka na úrovni 4. Tretiu farbiacu
nádobu naplníme premývacím tlmivým roztokom 2, zahriatym na 37 °C a
stojan so sklíčkom premiestnime do tejto nádoby. Premiešavame 1 min.
11. Pri práci s premytým microarray sklíčkom a jeho skenovaní je
dôležité, aby prostredie, v ktorom sa pracuje, neobsahovalo viac ako 5
ppb (asi 10 μg/m3) ozónu. Prítomnosť vyšších koncentrácií ozónu môže
negatívne ovplyvniť kvalitu signálu pri Cy5 a tým znížiť presnosť
výsledkov. V prípade, že používame microarray skener so systémom
ochrany pred ozónom (napr. so špeciálnym filtračným systémom priamo v
prístroji), premytý čip vložíme do držiaka sklíčok aktívnou stranou
nahor a môžeme skenovať. Pri použití ostatných prístrojov microarray
čip vložíme do držiaka sklíčok a prikryjeme krytom s ochranou voči
ozónu. Vhodné je tiež premytie čipu v acetonitrile a stabilizačnom
roztoku. V poradí štvrtú farbiacu nádobu v digestore naplníme
acetonitrilom a piatu nádobu stabilizačným roztokom, ktorý predtým
zahrejeme v digestore na 40 °C. Do nádoby s acetonitrilom premiestnime
stojan so sklíčkom z tretej nádoby a premiešavame 10 s. Potom stojan so
sklíčkom premiestnime do nádoby so stabilizačným roztokom. Premiešavame
30 s.
12. Microarray čip skenujeme v microarray skeneri postupom podľa
manuálu k prístroju a podľa manuálu k príslušnému akvizičnému a
analyzačnému softvéru. Zvyčajne najskôr zadáme skenovacie parametre,
čip vložíme do skenera a spustíme skenovanie. Importujeme súbor GAL
(ATF), ktorý obsahuje informácie o polohe každého bodu na čipe -
mriežku obsahujúcu jednotlivé parametre (bodové rozostupy, priemer,
atď.). Následne importujeme súbor (tzv. sample ID list – vo formáte
txt.
alebo xls.) obsahujúci informácie o konkrétnych génoch,
reprezentujúcich jednotlivé body na čipe. Definujeme dodatočné
parametre analýzy a uskutočníme samotnú analýzu – kvantifikáciu pre
konkrétny bod na čipe. Výsledkom analýzy je tabuľka s hodnotami pre
každý bod čipu – okrem iných aj hodnoty pomerov priemerov (mediánov)
intenzít pri rôznych vlnových dĺžkach (reprezentujúcich napr. Cy3 vs.
Cy5, čiže v exponovanej vs. kontrolnej skupine). Vzhľadom na množstvo
údajov, získané dáta sa zvyčajne ďalej sumarizujú, graficky znázorňujú
a hodnotia špecializovaným softvérom.