DNA / expresné / proteínové microarrays - MANUÁLY

Detekcia zmien expresie génov po expozícii toxickou látkou pomocou technológie microarrays

Anotácia: Bunky reagujú na podnety z okolia vrátane pôsobenia toxických látok zmenou expresie niektorých génov. Na skríning génov, ktorých expresia sa zmenila, možno využiť technológiu microarrays (expresné čipy), kde v rámci jednej reakcie je možné analyzovať tisíce génov súčasne. V našom experimente na detekciu zmien expresie génov využijeme expresný čip GE 4x44K (http://www.agilent.com) a súpravy chemikálií pre dvojfarbičkovú metódu značenia a analýzy. Na analýzu využijeme RNA, vyizolovanú z kultivovaných buniek – zo skupiny buniek, ktorá bola exponovaná toxickou látkou (vzorka A) a kontrolnej skupiny buniek (bez expozície, vzorka B). 

Chemikálie a materiál: komerčné súpravy pre prípravu a dvojfarbičkové značenie cRNA, prípravu kontrolných „Spike“ roztokov a hybridizáciu cRNA (http://www.agilent.com), obsahujúce roztoky „Spike A“ a „Spike B“, riediaci tlmivý roztok, T7 Primer mix, 5× RT tlmivý roztok, DTT (0,1 M), dNTP (10 mM), enzymatickú zmes, 5× transkripčný tlmivý roztok, T7 RNA polymerázovú enzymatickú zmes, Cyanine 3-CTP (Cy3) a Cyanine 5-CTP (Cy5), 10× blokovacie činidlo, 25x fragmentačný roztok, 2× Hi-RPM hybridizačný roztok, premývacie tlmivé roztoky 1 a 2, Triton X-102 (10 %), stabilizačný roztok; RNase/DNase-free sterilná voda; acetonitril; izopropanol; RNeasy Mini Kit (Qiagen); ľad; vyizolovaná RNA 

Pomôcky a vybavenie: microarray skener, microarray čip s tesniacim sklíčkom, hybridizačná komôrka, inkubátor, vodný kúpeľ, centrifúga, vortex, spektrofotometer, hybridizačná piecka, magnetická miešačka s miešadielkami, stojan na sklíčka, pipety, farbiace nádoby na premývanie, špičky, rukavice, mikroskúmavky 1,5 ml. 

Postup:
1. Na analýzu potrebujeme vyizolovanú RNA (celková RNA alebo poly-A RNA) zo vzoriek, v ktorých chceme porovnať expresiu génov - v našom experimente ide o celkovú RNA z kultivovaných exponovaných buniek (vzorka A) a kontrolnej skupiny buniek (bez expozície, vzorka B). Na izoláciu využijeme niektorý z dostupných postupov alebo komerčných súprav. Pre úspešný priebeh analýzy potrebujeme aspoň 10 - 200 ng celkovej RNA alebo min. 5 ng poly-A RNA.
2. Pripravíme si kontrolné roztoky „Spike A“ a „Spike B“. Tieto roztoky obsahujú súbory transkriptov - pozitívnych kontrol, ktoré prejdú všetkými krokmi od značenia nukleovej kyseliny až po skenovanie a vyhodnotenie. Umožnia porovnanie dát analyzovaných transkriptov (zo vzoriek) s dátami kontrolných transkriptov so známou koncentráciou a vzájomnými pomermi, čím sa zvýši presnosť analýzy. Skúmavky s jednotlivými zásobnými roztokmi najskôr inkubujeme 5 min. pri 37 °C vo vodnom kúpeli a roztoky následne riedime sterilnou vodou. Ak množstvo vyizolovanej RNA je 25 ng, riedenie uskutočníme nasledovne: Spike A roztok inkubujeme 5 min. pri 37 °C a zvortexujeme a krátko centrifugujeme. 2 μl roztoku napipetjeme do novej 1,5 ml skúmavky a pridáme 38 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:20). V ďalšom riedení zmiešame 2 μl roztoku z prvého riedenia a 78 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:40). V treťom riedení zmiešame 2 μl roztoku z druhého riedenia a 30 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:16). V poslednom riedení zmiešame 4 μl roztoku z tretieho riedenia a 28 μl riediaceho tlmivého roztoku (riedenie 1:8). Riedením získame celkovo 102 400-krát zriedený roztok. 2 μl takto zriedeného Spike A roztoku zmiešame s 1,5 μl celkovej RNA (25 ng) zo vzorky A (exponovaná). Podobne uskutočníme riedenie Spike B roztoku a 2 μl takto zriedeného roztoku zmiešame s 1,5 μl celkovej RNA (25 ng) zo vzorky B (kontrolná). Výsledkom tohto kroku sú dve 1,5 ml skúmavky s RNA vzorky A a Spike A mixom (3,5 μl), resp. RNA zo vzorky B so Spike B mixom (3,5 μl). Ak množstvo vyizolovanej RNA je iné ako 25 ng, riedenie uskutočníme podľa manuálu ku Spike kitu pre príslušnú koncentráciu RNA.
3. Do každej z 1,5 ml skúmaviek z predchádzajúceho kroku pridáme 1.8 μl T7 Primer mixu, obsah zdenaturujeme inkubáciou 10 min. pri 65 °C vo vodnom kúpeli a skúmavky vložíme do ľadu na 5 min. Výsledný objem v každej skúmavke bude 5,3 μl.
4. Uskutočníme reverznú transkripciu RNA do cDNA. V 1,5 ml skúmavke pripravíme cDNA reakčnú zmes - zmiešame 4 μl 5× RT tlmivého roztoku (ktorý pred použitím predhrejeme 3-4 min. pri 80°C), 2 μl DTT (0,1 M), 1 μl dNTP (10 mM) a 2,4 μl enzymatickej zmesi. Do každej z 1,5 ml skúmaviek z predchádzajúceho kroku pridáme 4,7 μl pripravenej cDNA reakčnej zmesi a skúmavky inkubujeme 2 hod. pri 40 °C, potom 15 min. pri 70 °C a napokon 5 min. na ľade. Výsledný objem v každej skúmavke bude 10 μl.
5. V ďalšom kroku uskutočníme transkripciu cDNA do cRNA so súčasným zabudovaním fluorescenčných farbičiek Cyanine 3-CTP (Cy3) a Cyanine 5-CTP (Cy5). V jednej 1,5 ml skúmavke pripravíme transkripčnú reakčnú zmes pre vzorku A - zmiešame 0,75 μl sterilnej vody, 3,2 μl 5× transkripčného tlmivého roztoku, 0,6 μl DTT (0,1 M), 1 μl NTP mixu, 0,21 μl T7 RNA polymerázovej enzymatickej zmesi a 0,24 μl Cyanine 3-CTP. V druhej 1,5 ml skúmavke pripravíme transkripčnú reakčnú zmes pre vzorku B - zmiešame všetky komponenty v rovnakých objemoch ako pre vzorku A s rozdielom farbičky – namiesto Cyanine 3-CTP do zmesi pridáme 0,24 μl Cyanine 5-CTP. Celý objem transkripčnej reakčnej zmesi zo skúmavky s Cyanine 3-CTP (6 μl) zmiešame s obsahom skúmavky s cDNA zo vzorky A so Spike A mixom z predchádzajúceho kroku. Celý objem transkripčnej reakčnej zmesi zo skúmavky s Cyanine 5-CTP (6 μl) zmiešame s obsahom skúmavky s cDNA zo vzorky B so Spike B mixom z predchádzajúceho kroku. Výsledný objem v každej skúmavke bude 16 μl. Skúmavky inkubujeme 2 hod. pri 40°C.
6. Zmesi z obidvoch skúmaviek prečistíme pomocou niektorého z dostupných komerčných kitov, napr. „RNeasy Mini Kit“ (Qiagen) alebo „Absolutely RNA Nanoprep Kit“ (Agilent). Postupujeme podľa manuálov k jednotlivým kitom. Po prečistení by sme mali získať 30 μl roztoku cRNA v každej skúmavke (tzv. elučný objem).
7. Pred uskutočnením hybridizácie je potrebné zmerať množstvo získanej cRNA a jej kvalitu pomocou spektrofotometra. Pri meraní množstva a kvality RNA postupujeme podľa odporúčaní výrobcu prístroja. Meraním získame nasledovné parametre: koncentráciu Cyanine 3 alebo Cyanine 5 (pmol/μl), pomer absorbancií pre RNA (260 nm/280 nm), koncentráciu RNA (ng/μl). Z uvedených parametrov vypočítame tzv. špecifickú aktivitu (pmol Cy3 alebo Cy5 / μg cRNA) a výťažok (μg) cRNA nasledovne:
((koncentrácia Cy3 alebo Cy5) / (koncentrácia cRNA)) x 1000 = pmol Cy3 alebo Cy5 / μg cRNA
((koncentrácia cRNA) x 30 μl (elučný objem)) / 1000 = μg cRNA
Pre využitie získanej cRNA v ďalšej analýze je potrebné, aby hodnota špecifickej aktivity bola ≥ 6 pmol Cy3 alebo Cy5 / μg cRNA a výťažok dosiahol aspoň 0,825 μg cRNA pre 4-políčkový formát microarray sklíčka (pre iné formáty sa vyžaduje iný výťažok cRNA podľa manuálu k microarray).
8. Pripravíme vzorky pre hybridizáciu na microarray čipe. Pridáme 500 μl sterilnej vody do skúmavky s lyofilizovaným 10× koncentrovaným blokovacím činidlom a vortexujeme. V 1,5 ml skúmavke zmiešame 825 ng cRNA označenej s Cy3 (vzorka A z bodu 5), 825 ng cRNA označenej s Cy5 (vzorka B z bodu 5), 11 μl roztoku blokovacieho činidla a doplníme sterilnou vodou do 52,8 μl. Do zmesi pridáme 2,2 μl 25x koncentrovaného fragmentačného roztoku a premiešame (celkový objem v skúmavke bude 55 μl). Uvedené množstvá sú potrebné pre hybridizáciu na jednom políčku 4-políčkového formátu microarray sklíčka (pre iné formáty sa vyžadujú iné množstvá jednotlivých komponentov podľa manuálu k microarray). Zmes inkubujeme presne 30 min. pri 60 °C, čím sa RNA fragmentuje. Následne zmes ochladíme na ľade 1 min. Do skúmavky potom pridáme rovnaký objem (55 μl) 2× koncentrovaného Hi-RPM hybridizačného roztoku, čím sa fragmentačná reakcia zastaví. Zmes jemne premiešame pipetou bez vytvorenia bubliniek. Skúmavku krátko scentrifugujeme, uložíme na ľad a čo najrýchlejšie uskutočníme hybridizáciu na sklíčku.
9. Uskutočníme hybridizáciu značenej a fragmentovanej cRNA na microarray čipe. Vložíme tesniace sklíčko do komôrky štítkom nahor, zarovno s obdĺžnikovým profilom komôrky. Opatrne napipetujeme vzorku z predchádzajúceho bodu do priestoru jedného zo štyroch políčok tak, aby sa nevytvorili bublinky. 4-políčkové sklíčko je určené pre realizáciu štyroch analýz, preto do zvyšných troch políčok môžeme napipetovať ďalšie vzorky z iných experimentov. Komôrku opatrne prikryte microarray sklíčkom jeho aktívnou stranou nadol (aby číselný čiarový kód na sklíčku smeroval nahor). Komôrku so sklíčkami následne prikryjeme krycou časťou a pritiahneme skrutkovou svorkou. Komôrku vertikálne pootáčame, čím navlhčíme obsah políčok a posúdime pohyb vzduchových bublín. Komôrku umiestnime do rotačnej časti (rotátora) hybridizačnej komory (piecky). Rotačnú rýchlosť rotátora nastavíme na 10 rpm, teplotu komory na 65 °C a čipy necháme hybridizovať 17 hod.
10. Čip premyjeme v dvoch premývacích tlmivých roztokoch 1 a 2 (sú súčasťou kitu), do ktorých pred použitím pridáme Triton X-102 (10 %) do výslednej koncentrácie 0,005 %. Všetko laboratórne vybavenie, používané na premývanie – farbiace nádoby, stojany na sklíčka, miešadielka atď., pred použitím očistíme v acetonitrile (tie, ktoré boli vystavené stabilizačnému roztoku, pozri ďalej) alebo v izopropanole (ostatné vybavenie) a opláchneme sterilnou vodou. Pripravíme si tri farbiace nádoby: prvú nádobu naplníme premývacím tlmivým roztokom 1; do druhej nádoby vložíme stojan na sklíčka a magnetické miešadielko, nádobu umiestnime na magnetickú miešačku a nádobu naplníme premývacím tlmivým roztokom 1; tretiu nádobu neskôr naplníme premývacím tlmivým roztokom 2, zahriatym na 37 °C. Po vytiahnutí komôrky s čipom z hybridizačnej piecky komôrku opatrne rozoberieme a spojené microarray sklíčko s 4-políčkovým sklíčkom ponoríme do prvej nádoby s premývacím tlmivým roztokom 1. V roztoku opatrne oddelíme microarray sklíčko od 4-políčkového sklíčka a microarray sklíčko premiestnime do stojana na sklíčka v druhej nádobke s premývacím tlmivým roztokom 1. Premiešavame 1 min. pri nastavení rotácie miešadielka na úrovni 4. Tretiu farbiacu nádobu naplníme premývacím tlmivým roztokom 2, zahriatym na 37 °C a stojan so sklíčkom premiestnime do tejto nádoby. Premiešavame 1 min.
11. Pri práci s premytým microarray sklíčkom a jeho skenovaní je dôležité, aby prostredie, v ktorom sa pracuje, neobsahovalo viac ako 5 ppb (asi 10 μg/m3) ozónu. Prítomnosť vyšších koncentrácií ozónu môže negatívne ovplyvniť kvalitu signálu pri Cy5 a tým znížiť presnosť výsledkov. V prípade, že používame microarray skener so systémom ochrany pred ozónom (napr. so špeciálnym filtračným systémom priamo v prístroji), premytý čip vložíme do držiaka sklíčok aktívnou stranou nahor a môžeme skenovať. Pri použití ostatných prístrojov microarray čip vložíme do držiaka sklíčok a prikryjeme krytom s ochranou voči ozónu. Vhodné je tiež premytie čipu v acetonitrile a stabilizačnom roztoku. V poradí štvrtú farbiacu nádobu v digestore naplníme acetonitrilom a piatu nádobu stabilizačným roztokom, ktorý predtým zahrejeme v digestore na 40 °C. Do nádoby s acetonitrilom premiestnime stojan so sklíčkom z tretej nádoby a premiešavame 10 s. Potom stojan so sklíčkom premiestnime do nádoby so stabilizačným roztokom. Premiešavame 30 s.
12. Microarray čip skenujeme v microarray skeneri postupom podľa manuálu k prístroju a podľa manuálu k príslušnému akvizičnému a analyzačnému softvéru. Zvyčajne najskôr zadáme skenovacie parametre, čip vložíme do skenera a spustíme skenovanie. Importujeme súbor GAL (ATF), ktorý obsahuje informácie o polohe každého bodu na čipe - mriežku obsahujúcu jednotlivé parametre (bodové rozostupy, priemer, atď.). Následne importujeme súbor (tzv. sample ID list – vo formáte txt. alebo xls.) obsahujúci informácie o konkrétnych génoch, reprezentujúcich jednotlivé body na čipe. Definujeme dodatočné parametre analýzy a uskutočníme samotnú analýzu – kvantifikáciu pre konkrétny bod na čipe. Výsledkom analýzy je tabuľka s hodnotami pre každý bod čipu – okrem iných aj hodnoty pomerov priemerov (mediánov) intenzít pri rôznych vlnových dĺžkach (reprezentujúcich napr. Cy3 vs. Cy5, čiže v exponovanej vs. kontrolnej skupine). Vzhľadom na množstvo údajov, získané dáta sa zvyčajne ďalej sumarizujú, graficky znázorňujú a hodnotia špecializovaným softvérom.