Izolácia RNA - Manuály
Izolácia RNA z
pečene
Chemikálie: TRIZOL, chloroform, izopropanol, 75 % etanol
(pripravený z DEPC vody), DEPC – voda, 100 mg pečene a 100 mg
podkožného tukového tkaniva z ošípanej, (zmrazené a skladované v
tekutom dusíku)
Pomôcky: mikropipety, PE piestik na homogenizáciu, RNase-free
skúmavky a špičky, vortex, chladená centrifúga, rukavice
Postup:
1. k 50-100 mg zmrazeného tkaniva pridáme 1 ml reagencie TRIZOL a
plastovým piestikom dôkladne tkanivo zhomogenizujeme; inkubujeme 5 min.
pri laboratórnej teplote
2. pridáme 0,2 ml chloroformu a intenzívne premiešame počas 15 s na
vortexe; inkubujeme ďalšie 2-3 min. pri laboratórnej teplote
3. centrifugáciou pri 12 000 x g počas 20 min. pri 4 °C oddelíme vrchnú
vodnú fázu (číra, obsahuje RNA) a spodnú organickú fázu (sfarbená do
červena, s obsahom DNA a proteínov); na rozhraní fáz sa nachádza ešte
tenká vrstva jemnej bielej zrazeniny
4. pipetou prenesieme vrchnú, vodnú fázu do čistej skúmavky a pridáme k
nej 0,5 ml izopropanolu, premiešame a inkubujeme pri laboratórnej
teplote 10 min., počas inkubácie sa vyzráža RNA
5. centrifugujeme pri 12 000 x g počas 15 min. pri 4 °C; sedimentovanú,
vyzrážanú RNA môžeme uvidieť ako malý gélový pelet na dne skúmavky
6. pipetou odoberieme roztok nad sedimentom (supernatant) POZOR!!!
Niekedy pelet nie je dobre viditeľný, supernatant treba odoberať
opatrne!
7. k sedimentovanej RNA pridáme 1 ml 75 % etanolu, premiešame a
centrifugujeme pri 12 000 x g počas 5 min pri 4 °C
8. supernatant odstránime pipetou a zrazeninu RNA vysušíme pri
laboratórnej teplote 5-10 min.
9. RNA rozpustíme v 15-20 μl sterilnej DEPC vode a zmrazíme pri – 70 °C