Izolácia RNA - Manuály

Izolácia RNA z pečene

Chemikálie: TRIZOL, chloroform, izopropanol, 75 % etanol (pripravený z DEPC vody), DEPC – voda, 100 mg pečene a 100 mg podkožného tukového tkaniva z ošípanej, (zmrazené a skladované v tekutom dusíku)

Pomôcky: mikropipety, PE piestik na homogenizáciu, RNase-free skúmavky a špičky, vortex, chladená centrifúga, rukavice

Postup:
1. k 50-100 mg zmrazeného tkaniva pridáme 1 ml reagencie TRIZOL a plastovým piestikom dôkladne tkanivo zhomogenizujeme; inkubujeme 5 min. pri laboratórnej teplote
2. pridáme 0,2 ml chloroformu a intenzívne premiešame počas 15 s na vortexe; inkubujeme ďalšie 2-3 min. pri laboratórnej teplote
3. centrifugáciou pri 12 000 x g počas 20 min. pri 4 °C oddelíme vrchnú vodnú fázu (číra, obsahuje RNA) a spodnú organickú fázu (sfarbená do červena, s obsahom DNA a proteínov); na rozhraní fáz sa nachádza ešte tenká vrstva jemnej bielej zrazeniny
4. pipetou prenesieme vrchnú, vodnú fázu do čistej skúmavky a pridáme k nej 0,5 ml izopropanolu, premiešame a inkubujeme pri laboratórnej teplote 10 min., počas inkubácie sa vyzráža RNA
5. centrifugujeme pri 12 000 x g počas 15 min. pri 4 °C; sedimentovanú, vyzrážanú RNA môžeme uvidieť ako malý gélový pelet na dne skúmavky
6. pipetou odoberieme roztok nad sedimentom (supernatant) POZOR!!! Niekedy pelet nie je dobre viditeľný, supernatant treba odoberať opatrne!
7. k sedimentovanej RNA pridáme 1 ml 75 % etanolu, premiešame a centrifugujeme pri 12 000 x g počas 5 min pri 4 °C
8. supernatant odstránime pipetou a zrazeninu RNA vysušíme pri laboratórnej teplote 5-10 min.
9. RNA rozpustíme v 15-20 μl sterilnej DEPC vode a zmrazíme pri – 70 °C