High resolution melting (HRM) - popis metódy

High resolution melting (HRM) je tzv. post PCR metóda, ktorá sa využíva predovšetkým na analýzu genetických variácií (mutácií) v sekvenciách nukleových kyselín, stanovenie genotypov a hľadanie mutácií, či identifikáciu polymorfizmov v produktoch PCR reakcie. Táto metóda poskytuje alternatívu k iným metódam, pomocou ktorých je možné identifikovať genetické polymorfizmy a mutácie, ako sú napr. sekvenovanie DNA alebo viaceré modifikácie PCR (napr. PCR-RFLP). HRM sa využíva najmä v prípadoch, kde oproti iným spomenutým metódam poskytuje výhodu. Ak je zoptimalizovaná na detekciu konkrétnej mutácie a nie je potrebné poznať celú sekvenciu DNA v okolí mutácie, HRM predstavuje lacnejšiu metódu v porovnaní so sekvenovaním. Oproti PCR-RFLP sa HRM využíva v prípade, že je potrebné identifikovať mutáciu, ktorú v rámci sekvencie nerozpoznáva žiadna restrikčná endonukleáza.

Keďže HRM je post PCR metóda, genetická variabilita v DNA sa deteguje tak, že daná sekvencia s mutáciou/polymorfizmom sa najskôr amplifikuje pomocou PCR. PCR amplifikácia cieľovej sekvencie sa uskutočňuje v prítomnosti fluorescenčnej farbičky (Eva Green, LC Green a iné), ktorá vykazuje vysokú fluorescenciu po naviazaní na dsDNA (dvojvláknovú DNA) a nízku fluorescenciu v nenaviazanom stave. Pri tepelnej zmene PCR produktu - denaturácii dvojvláknovej DNA na jednovláknovú v prítomnosti fluorescenčnej farbičky tak nastávajú zmeny vo fluorescencii - prítomná farbička sa uvoľní a fluorescencia sa zníži. Po PCR reakcii sa produkt postupne zahrieva až na teplotu topenia a vyžarovaná fluorescencia je postupne zaznamenávaná špecializovanými prístrojmi, ktoré z nameraných hodnôt vytvoria charakteristickú krivku. Fluorescenčný profil krivky topenia sa v prítomnosti mutácie (polymorfizmu) zmení, čím sa daná mutácia (polymorfizmus) identifikuje. 

Zmenu fluorescenčnej krivky v prítomnosti mutácie znázorňuje nasledovný obrázok.