ELISA - popis metódy

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) je jednou z najrozšírenejších imunologických metód, ktorá vďaka svojej jednoduchosti, citlivosti a mnohostrannosti našla široké uplatnenie vo všetkých oblastiach biomedicínskeho výskumu. ELISA umožňuje detegovať a kvantifikovať rôzne látky (=antigény), napr. niektoré toxíny, hormóny, množstvo proteínov, prípadne ďalších bioaktívnych látok. Môžeme ňou stanoviť aj protilátky. Existuje viacero typov ELISA. Podľa spôsobu zostavenia imunoanalýzy môžeme antigén alebo protilátku stanoviť v testovanej vzorke buď sendvičovou, nepriamou alebo kompetičnou ELISA. Prehľad typov ELISA prezentuje nasledovný obrázok.

Na detekciu látok (antigénu) vo vzorke sa často využíva sendvičová ELISA, keďže test v takomto usporiadaní je veľmi citlivý a dajú sa ním identifikovať veľmi nízke hladiny antigénu. Na nosič (mikrotitračná platňa) sa naviaže protilátka (tzv. záchytná protilátka) k stanovovanému antigénu. Pridá sa analyzovaný antigén, pričom sa vytvorí komplex protilátka-antigén. Tento komplex sa ďalej deteguje ďalšou protilátkou (tzv. primárna protilátka), ktorá má na sebe naviazaný enzým (najčastejšie chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, beta-galaktozidáza). Obidve protilátky, záchytná aj primárna musia byť špecifické k danému antigénu. Pretože s jednou molekulou antigénu reagujú dve molekuly protilátky, podmienkou je, aby viazali rôzne miesta (epitopy) na danom antigéne. Po vymytí nadbytočnej protilátky, ktorá sa v reakcii na antigén nenaviazala, sa k reakčnej zmesi pridá substrát pre daný enzým. Enzým následne substrát rozštiepi, čím sa zmení farba reakčnej zmesi. Vyššia koncentrácia určovanej látky naviaže väčšie množstvo protilátky, a teda aj enzýmu, ktorý potom rozštiepi viac substrátu a reakcia sa prejaví intenzívnejším sfarbením. Intenzita sfarbenia sa meria fotometricky, čím sa získajú kvantitatívne dáta o sfarbení reakčnej zmesi. Ak je primárna protilátka priamo značená enzymaticky, hovoríme o priamej sendvičovej ELISA. V prípade, že primárna protilátka nenesie enzýmovú značku, vzniknutý komplex sa deteguje ešte ďalšou, enzymaticky značenou protilátkou – tzv. sekundárnou protilátkou. Ide o protilátku špecifickú k primárnej protilátke, schopnú viazať sa na Fc oblasť primárnej protilátky. 

Antigény (látky) možno stanoviť aj tzv. kompetičnou ELISA. Na dno mikrotitračnej platne sa naviaže protilátka špecifická pre antigén, ktorý sa má stanoviť. V ďalšom kroku sa pridá testovaný antigén spolu s enzymaticky značeným antigénom a zmes sa inkubuje. V tomto štádiu dochádza k súťažení - kompetícii medzi značeným a testovaným antigénom o väzbu na protilátku. Voľné nenaviazané antigény sa premývaním odstránia a zostanú len tie, ktoré sú naviazané na imobilizovanú protilátku. Čím viac testovaného antigénu bolo vo vzorke, tým menej štandardného značeného antigénu vytvorí komplex s protilátkou. Potom sa pridá substrát, ktorý enzým prítomný v imunokomplexe rozloží, výsledkom čoho je farebná reakcia, ktorá sa meria spektrofotometricky. Tento typ imunoanalýzy sa veľmi často používa na kvantitatívne merania vzoriek s relatívne vysokou koncentráciou antigénov alebo nízkou molekulovou hmotnosťou (napr. stanovenie hormónov). 

Na detekciu protilátok sa často používa nepriama ELISA. V tomto prípade je dno mikrotitračnej platne pokryté antigénom, špecifickým pre stanovovanú protilátku. Protilátka nachádzajúca sa vo vzorke sa tak po pridaní na platňu špecificky naviaže na antigén. Potom sa pridá enzymaticky značená sekundárna protilátka, ktorá sa špecificky viaže na stanovovanú protilátku. Nenaviazané reagencie sa odstránia premývaním a po nasledujúcej aplikácii enzýmového substrátu sa meria intenzita farebnej reakcie. Sekundárna protilátka musí byť špecifická k primárnej stanovovanej protilátke a musí sa viazať na jej Fc oblasť. Ak je napr. primárna protilátka myšacia, sekundárna protilátka musí byť anti-myšacia, teda namierená voči myšacím imunoglobulínom. Takáto protilátka potom špecificky viaže každú myšaciu protilátku. Sekundárne protilátky sú väčšinou polyklonálne antiséra, ktoré sú afinitne purifikované a potom konjugované s enzýmom.