ELISA - manuály

Stanovenie kazeínu v sére, plazme a iných biologických tekutinách pomocou sendvičovej ELISA

Anotácia: Sendvičová ELISA je citlivá metóda pre kvantifikáciu substancií (ako sú napr. hormóny, produkty „cell signaling“, antigénov infekčných ochorení, cytokínov atď.) v množstvách od pikogramov po mikrogramy. Uvedenú metódu využijeme na stanovenie obsahu kazeínu v sére. V súčasnosti sa využívajú komerčne dostupné ELISA súpravy, ktoré obsahujú takmer všetky potrebné reagencie. Súprava, ktorú využijeme pri našom experimente (http://www.antibodies-online.com), umožňuje detekciu kazeínu v rozsahu 62,5-4000 pg/ml vzorky.

Chemikálie: ELISA mikrotitračná platnička, 8 x 12 jamiek s naviazanou protilátkou proti kazeínu, štandard kazeínu + diluent, biotinylovaná detekčná protilátka + diluent, HRP Conjugate (konjugát k detekčnej protilátke s peroxidázou) + Diluent, premývací roztok, roztok substrátu, roztok na zastavenie reakcie, platničkový uzáver.  

Pomôcky: čítač platničiek - Microplate reader s filtrom pre 450nm, mikropipety, mikroskúmavky, inkubátor pre 37°C, deionizovaná voda.

Postup:
1. Najskôr nariedime všetky reagenty zo zásobných roztokov na požadované koncentrácie podľa manuálu. 30 ml koncentrovaného premývacieho roztoku rozriedime vodou na 750 ml. Štandard zriedime s 1 ml diluentu a necháme 10 min. rozpustiť, čím získame zásobný roztok, ktorý násobne nariedime. Taktiež nariedime koncentrovanú detekčnú protilátku s diluentom v pomere 1:100 a koncentrovaný konjugát HRP Conjugate s diluentom v rovnakom pomere. Substrát je citlivý na svetlo, preto fľaštičku otvoríme až pri použití v reakcii.
2. Vzorky, v ktorých stanovujeme kazeín musia byť čisté a bez pevných súčastí, ktoré odstránime centrifugáciou. Vzorky séra necháme vyzrážať 2 hod. pri izbovej teplote alebo cez noc pri 4°C, centrifugujeme 15 min. pri 1000×g a ihneď analyzujeme. V prípade plazmy ju odoberáme do antikoagulantu EDTA alebo heparinu a centrifugujeme 15 min. pri 1000×g pri 2 - 8°C do 30 min. od odberu. Supernatant ihneď analyzujeme. V prípade nutnosti je možné vzorky uskladniť pri 2-8°C max. 7 dní, pri -20°C max. mesiac alebo pri -80°C 6 mesiacov. Dôležité je vyhnúť sa opätovnému zmrazovaniu a rozmrazovaniu vzoriek.
3. Odporúča sa každú vzorku analyzovať dvojmo. Do jamiek na ELISA platničke pridáme 100μl roztokov štandardov a do ďalších jamiek rovnaké objemy vzoriek, jemne zamiešame. Platničku zakryjeme a inkubujeme 90 min. pri 37°C.
4. Roztok z jamiek odstránime a do každej jamky pridáme 100μl roztoku biotinylovanej detekčnej protilátky. Platničku zakryjeme a jemne zamiešame. Inkubujeme 1 hod. pri 37°C.
5. Roztok z jamiek odstránime a jamky 3x premyjeme premývacím roztokom (každá jamka "spotrebuje" cca  350μl premývacieho roztoku). Premývanie môžeme uskutočniť pipetovaním alebo s využitím automatickej premývačky ELISA platničiek. Dôkladné premytie a odstránenie zvyškov premývacieho roztoku po poslednom premytí je veľmi dôležité. Platničku otčíme dnom nahor a dôkladne poklepeme na filtračnom papieri.
6. Do jamiek pridáme 100μl roztoku HRP Conjugate. Platničku zakryjeme a inkubujeme 30 min. pri 37°C.
7. Zopakujeme proces premývania jamiek 5x postupom ako v kroku 5.
8. Do jamiek pridáme 90μl roztoku substrátu. Platničku zakryjeme a inkubujeme 15 min. pri 37°C. Platnička musí byť starostlivo zakrytá, aby k nej nepreniklo svetlo. Reakčný čas stanovíme na základe aktuálneho sfarbenia, nemal by však presiahnuť 30 min. 
9. Do jamiek pridáme 50μl roztoku na zastavenie reakcie. Sfarbenie sa zmení na žlté. Roztok pridávame do jamiek v rovnakom poradí ako v prípade roztoku substrátu v kroku 8.
10. Zmeriame optickú denzitu (OD) v jednotlivých jamkách platničky s použitím čítača platničiek pri 450 nm.
11. Spriemerujeme hodnoty OD rovnakých štandardov a rovnakých vzoriek, analyzovaných dvojmo. Zostrojíme štandardnú krivku z OD hodnôt štandardov (os y) a ich koncentrácií (os x). Krivku najpresnejšie zostrojíme pomocou profesionálneho softvéru. Koncentrácie kazeínu v jednotlivých vzorkách zistíme na základe štandardnej krivky podľa ich OD a riediaceho faktora.